突變敏感性開關(guān)檢測(cè)妊高壓相關(guān)基因AGT多態(tài)性研究.pdf

1、蘇州大學(xué)學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所提交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不含其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不含為獲得蘇州大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位證書而使用過的材料。對(duì)本文的研究作出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人承擔(dān)本聲明的法律責(zé)任。論文作者簽名：』年址日突變敏感性開關(guān)檢測(cè)妊高壓相關(guān)基因AGT多態(tài)性研究中文提要突變敏感性開關(guān)檢測(cè)妊高壓

2、相關(guān)基因AGT多態(tài)性研究中文提要目的：本文是研究用硫代磷酸酯修飾的堿基特異性引物結(jié)合高保真聚合酶所組成的突變敏感性分子“開／關(guān)“檢測(cè)AGT基因T174M和M235T的熱點(diǎn)突變。同時(shí)將該研究方法結(jié)合目前廣泛應(yīng)用于臨床的熒光定量PCR技術(shù)，其特異性強(qiáng)，靈敏度高，全封閉等特點(diǎn)實(shí)現(xiàn)更理想分子診斷方法。方法：從數(shù)據(jù)庫中分析AGT的SNP(singlenucleotidepolymophism，單核苷酸多態(tài)1結(jié)合文獻(xiàn)中AGT高頻突變位點(diǎn)T174M和

3、M235T與妊娠高血壓的相關(guān)性。從人血液基因組中擴(kuò)增兩個(gè)突變基因的DNA片段，將擴(kuò)增產(chǎn)物與pMDl9T連接，轉(zhuǎn)化至EcoliTOPl0感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建野生型載體質(zhì)粒。用一種基因工程常用的細(xì)菌重組子的篩選方法篩選出正確克隆，用pMDl9T通用引物和DNA片段對(duì)應(yīng)引物對(duì)挑選到的白色克隆用PCR方法鑒定，電泳結(jié)果中選出目標(biāo)DNA經(jīng)克隆測(cè)序以驗(yàn)證是否是目標(biāo)克隆，確認(rèn)AGT基因野生型模板。采用重疊延伸PCR技術(shù)，對(duì)基因多態(tài)分析位置的堿基用PCR

4、單堿基突變，得到T174M和M235T兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)基因型DNA片段，定向克隆方法后的產(chǎn)物同樣用藍(lán)白斑篩選技術(shù)選出目標(biāo)條帶，這些新構(gòu)建的載體通過DNA測(cè)序確認(rèn)。再以T174M和M235T為檢測(cè)位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)37末端野生型基因位點(diǎn)的引物及37末端硫化修飾突變引物；高保真DNA聚合酶介導(dǎo)的突變敏感性分子開關(guān)，檢測(cè)AGT基因野生型質(zhì)粒模板和突變型質(zhì)粒模板，瓊脂糖凝膠電泳成像結(jié)果分析。將該檢測(cè)方法應(yīng)用于一般PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR中可以檢測(cè)低至