高山離子芥冷調(diào)節(jié)基因CbCOR15提高轉(zhuǎn)基因煙草抗寒性的研究.pdf

1、高山離子芥Chorispora bungeana是一種典型的高山冰緣植物，具有很強(qiáng)的抗凍性，是研究植物適應(yīng)冷凍環(huán)境分子機(jī)制的理想材料。我們從高山離子芥中克隆得到一種新的冷調(diào)節(jié)基因，命名為CbCOR15。使用半定量PCR技術(shù)對(duì)CbCOR15在不同組織中和不同脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行了研究。CbCOR15切除推測(cè)的葉綠體跨膜導(dǎo)肽序列得到CbCOR15m，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法將CbCOR15，CbCOR15m轉(zhuǎn)入煙草中，分析轉(zhuǎn)基因煙草的抗逆性。

2、結(jié)果如下：
　　 1.使用RACE技術(shù)擴(kuò)增得到完整的高山離子芥冷調(diào)節(jié)基因CbCOR15，將cDNA序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(序列接受號(hào)為EF208112)。CbCOR15基因全長(zhǎng)612bp，包含一個(gè)423 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)，編碼140個(gè)氨基酸的蛋白，起始密碼子前面有83 bp的5'非翻譯區(qū)，編碼區(qū)后面有106 bp包含poly(A)的3'非翻譯區(qū)。軟件計(jì)算高山離子芥CbCor15蛋白的等電點(diǎn)為5.20，推測(cè)其分子量為1

3、4.9kDa。CbCor15蛋白與已知的ApCOR15a、AtCOR15a、AtCOR15b、 BN115、CBCOR15等蛋白高度同源。說(shuō)明CbCOR15屬于COR15基因家族。在植株受到環(huán)境低溫脅迫時(shí)，該基因家族的基因通常在與植物生長(zhǎng)相關(guān)的組織中表達(dá)。
　　 2.序列分析顯示，CbCor15蛋白富含親水性氨基酸，具有很高的親水性，特別是C-terminal2/3的區(qū)域中幾乎都是親水域。α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)交錯(cuò)構(gòu)成了二級(jí)結(jié)構(gòu)

4、的主要部分。軟件分析推測(cè)在CbCor15蛋白的N-terminal存在葉綠體跨膜導(dǎo)肽。說(shuō)明CbCor15蛋白很可能是切除導(dǎo)肽序列進(jìn)入葉綠體后形成成熟的蛋白CbCor15m，保護(hù)細(xì)胞膜與葉綠體膜系統(tǒng)的完整性，提高植株的抗逆能力。
　　 3.研究CbCOR15基因在不同組織和不同脅迫處理中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)2℃冷脅迫1 d的植株，只能在葉片中檢測(cè)到CbCOR15基因的表達(dá)，在根中檢測(cè)不到表達(dá)。說(shuō)明CbCOR15是一個(gè)組織特異性表達(dá)的基

5、因，與其定位于葉綠體的推測(cè)相吻合；CbCOR15基因在冷凍低溫(4℃，0℃，-4℃)處理下誘導(dǎo)表達(dá)，到第7天仍保持在較高水平。而且處理溫度越低，表達(dá)越迅速，-4℃時(shí)的表達(dá)量最快達(dá)到頂峰。說(shuō)明CbCOR15是一種冷誘導(dǎo)的功能基因，長(zhǎng)期保護(hù)植株免受低溫傷害，對(duì)植株抵御冷凍低溫起重要作用。另外，CbCOR15基因還可以被ABA，PEG誘導(dǎo)表達(dá)，但不能被H2O2誘導(dǎo)表達(dá)。說(shuō)明CbCOR15參與多種脅迫的調(diào)節(jié)途徑(如冷凍脅迫，脫水脅迫)，但不參與

6、清除活性氧的調(diào)節(jié)途徑。
　　 4.通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法將CbCOR15和CbCOR15m導(dǎo)入煙草葉片中。使用分子生物學(xué)方法分析不同轉(zhuǎn)基因植株中外源基因在RNA水平和蛋白水平的表達(dá)量。結(jié)果顯示不同植株中外源插入基因的RNA水平和蛋白水平的表達(dá)量存在很大差異，但RNA水平和蛋白水平的表達(dá)量是相對(duì)應(yīng)的。研究高量表達(dá)外源基因的植株和低量表達(dá)外源基因的植株抵抗低溫的能力，發(fā)現(xiàn)低溫處理下它們的相對(duì)電導(dǎo)率，MDA含量，葉綠素含量和相對(duì)含水量

7、等抗逆性的理指標(biāo)沒(méi)有顯著差異。說(shuō)明植株抵抗低溫的能力與CbCOR15的積累不直接相關(guān)。推測(cè)單個(gè)COR基因表達(dá)量的積累只能有限的影響植株的抗逆性，植物抗寒性的提高是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，由一系列的基因聯(lián)合參與作用。
　　 5.研究轉(zhuǎn)基因煙草的抗寒性，發(fā)現(xiàn)CbCOR15轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出較對(duì)照植株和CbCOR15m轉(zhuǎn)基因植株更少的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量，更多的葉綠素含量和相對(duì)含水量。結(jié)果顯示在冷脅迫下CbCOR15轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性明顯高于

8、對(duì)照植株，而CbCOR15m轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性較之對(duì)照植株沒(méi)有提高。說(shuō)明切除了葉綠體導(dǎo)肽的CbCOR15m不能和CbCOR15一樣，通過(guò)保護(hù)質(zhì)膜穩(wěn)定性，防止水分流失和細(xì)胞結(jié)晶化，增強(qiáng)植物的抗寒性。在抗凍性的實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照植株的EL50僅為-2.1℃，而CbCOR15轉(zhuǎn)基因植株的EL50可達(dá)到-4℃。說(shuō)明CbCOR15能夠提高轉(zhuǎn)基因植株的抗凍性。我們認(rèn)為CbCOR15基因在轉(zhuǎn)基因煙草獲得抗寒/凍性中發(fā)揮重要作用。
　　 綜上所訴，高