七氟烷后處理對(duì)非糖尿病及糖尿病小鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及其與TOPK-PTEN-Akt通路的關(guān)系.pdf

1、第一部分 TOPK/PTEN/Akt通路在七氟烷后處理減輕心肌缺血再灌注損傷中的作用
　　目的：研究七氟烷后處理對(duì)心肌缺血再灌注或缺氧再?gòu)?fù)氧損傷的作用，并探討是否與TOPK/PTEN/Akt信號(hào)通路有關(guān)。
　　方法：雄性C57BL/6小鼠，15～16周齡，隨機(jī)分為五組：①假手術(shù)組（Sham）；②缺血再灌注損傷組（IR）；③七氟烷后處理組（Sevo-PostC）；④七氟烷后處理+LY294002組（Sevo-PostC+LY）

2、；⑤七氟烷后處理+HI TOPK-032組（Sevo-PostC+HI）。建立小鼠心肌缺血再灌注損傷模型，即結(jié)扎冠脈左前降支后心肌缺血45分鐘并再灌注2小時(shí)，持續(xù)監(jiān)測(cè)小鼠血壓及心率。H9c2細(xì)胞使用含1000 mg/L葡萄糖的胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)3天，隨后進(jìn)行試驗(yàn)，同樣隨機(jī)分為五組：①對(duì)照組（Control）；②缺氧再?gòu)?fù)氧損傷組（HR）；③七氟烷后處理組（Sevo-PostC）；④七氟烷后處理+LY294002組（Sevo-PostC+L

3、Y）；⑤七氟烷后處理+HI TOPK-032組（Sevo-PostC+HI）。H9c2細(xì)胞建立缺氧再?gòu)?fù)氧模型即細(xì)胞缺氧3小時(shí)再?gòu)?fù)氧6小時(shí)。TTC染色評(píng)估心肌梗死，MTT法評(píng)估細(xì)胞活性，ELISA法檢測(cè)肌酸激酶同工酶（CK-MB）和比色法檢測(cè)乳酸脫氫酶（LD H）的濃度，TUNEL法評(píng)估心肌細(xì)胞凋亡狀況，Western Blot檢測(cè)心肌組織或細(xì)胞蛋白TOPK、PTEN、Akt及其磷酸化水平。
　　結(jié)果：在動(dòng)物水平，七氟烷后處理減輕了

4、心肌缺血再灌注的損傷，主要表現(xiàn)為提高小鼠再灌注末期平均動(dòng)脈壓、減少心肌梗死面積、降低心肌酶CK-MB和LDH水平及減少心肌細(xì)胞的凋亡（與IR組比較，P＜0.05）。在細(xì)胞水平，七氟烷后處理提高了缺氧再?gòu)?fù)氧后的細(xì)胞活性，并減少了LDH的釋放（與HR組比較，P＜0.05）。然而，TOPK或 PI3K抑制劑可消除七氟烷后處理的心肌保護(hù)作用（P＜0.05）。與 IR或HR組比較，七氟烷后處理可明顯升高蛋白TOPK、PTEN及Akt的磷酸化水平（

5、P＜0.05）。七氟烷后處理給予 TOPK抑制劑后降低了 PTEN及 Akt的磷酸化水平（Sevo-PostC組與 Sevo-PostC+HI組，P＜0.05），而給予 PI3K抑制劑后僅減少了Akt的磷酸化水平（Sevo-PostC組與Sevo-PostC+LY組，P＜0.05）。
　　結(jié)論：七氟烷后處理能有效減輕小鼠心肌缺血再灌注的損傷，且該作用可能與TOPK/PTEN/Akt通路激活有關(guān)。
　　第二部分 TOPK/PT

6、EN/Akt通路受損在糖尿病消除七氟烷后處理心肌保護(hù)中的作用
　　目的：研究糖尿病對(duì)七氟烷后處理心肌保護(hù)作用的影響，并探討是否與TOPK/PTEN/Akt信號(hào)通路受損有關(guān)。
　　方法：7～8周齡雄性C57BL/6小鼠采用連續(xù)腹腔注射40 mg/kg鏈脲佐菌素5天建立糖尿病模型，記錄小鼠的飲食飲水量、體重及血糖變化。8周后，糖尿病和非糖尿病小鼠隨機(jī)分為四組：①缺血再灌注損傷組（IR）；②七氟烷后處理組（Sevo-PostC）；

7、③糖尿病缺血再灌注損傷組（Diabetic+IR）；④糖尿病七氟烷后處理組（Diabetic+Sevo-PostC）。H9c2細(xì)胞使用含1000 mg/L或4500 mg/L葡萄糖的胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)3天，隨后進(jìn)行試驗(yàn)分組：①缺氧再?gòu)?fù)氧組（HR）；②七氟烷后處理組（Sevo-PostC）；③高糖缺氧再?gòu)?fù)氧組（HG+HR）④高糖七氟烷后處理組（HG+Sevo-PostC）；⑤載體腺病毒+高糖缺氧再?gòu)?fù)氧組（Ad-vector+HG+HR）；

8、⑥載體腺病毒+高糖七氟烷后處理組（Ad-vector+HG+Sevo-PostC）；⑦過(guò)表達(dá) TOPK腺病毒+高糖缺氧再?gòu)?fù)氧組（Ad-TOPK+HG+HR）；⑧過(guò)表達(dá)TOPK腺病毒+高糖七氟烷后處理組（Ad-TOPK+HG+Sevo-PostC）。TTC染色評(píng)估心肌梗死，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，ELISA法檢測(cè)肌酸激酶同工酶（CK-MB），比色法檢測(cè)乳酸脫氫酶（LDH）及丙二醛（MDA），羥胺法檢測(cè)總的超氧化物歧化酶（SOD）水平，TUN

9、EL法評(píng)估心肌細(xì)胞凋亡狀況，ROS探針評(píng)估心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，Western Blot檢測(cè)心肌組織或細(xì)胞蛋白TOPK、PTEN、Akt及其磷酸化水平。
　　結(jié)果：在動(dòng)物水平，糖尿病可加劇心肌缺血再灌注的損傷，主要表現(xiàn)為降低小鼠再灌注末期平均動(dòng)脈壓、增加心肌梗死面積、提高心肌酶CK-MB和LDH的釋放、加劇心肌細(xì)胞的凋亡、增加心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激（Diabetic+IR及Diabetic+Sevo-PostC組與 IR組比較，P＜

10、0.05），同時(shí)，糖尿病也消除了七氟烷后處理的心肌保護(hù)作用（Diabetic+IR組與Diabetic+Sevo-PostC組比較，P＞0.05）。在細(xì)胞水平，高糖同樣加劇了心肌細(xì)胞缺氧再?gòu)?fù)氧的損傷，顯著降低了缺氧再?gòu)?fù)氧后的細(xì)胞活性、增加LDH的釋放及心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激（HG+HR及HG+Sevo-PostC組與HR組比較，P＜0.05），高糖同樣也消除了七氟烷后處理的心肌保護(hù)作用（HG+HR組與 HG+Sevo-PostC組比較，P＞

11、0.05）。但是，心肌細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)TOPK后可明顯增加高糖刺激下缺氧再?gòu)?fù)氧后的細(xì)胞活性并減少 LDH的釋放（Ad-TOPK+HG+HR及Ad-TOPK+HG+Sevo-PostC組與Ad-vector+HG+HR組比較，P＜0.05）。糖尿病或高糖消除了七氟烷后處理誘導(dǎo)的蛋白 TOPK、PTEN及 Akt磷酸化升高的作用（Diabetic+Sevo-PostC組與 Diabetic+IR組比較，P＞0.05；HG+Sevo-PostC組

12、與HG+HR組比較，P＞0.05），同時(shí)也顯著減低了蛋白TOPK、PTEN及Akt的磷酸化（Diabetic+IR及 Diabetic+Sevo-PostC與 IR組比較，P＜0.05；HG+HR及HG+Sevo-PostC組與HR組比較，P＜0.05）。然而，心肌細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)TOPK后可以顯著增加高糖刺激下 PTEN及 Akt的磷酸化（Ad-TOPK+HG+HR及 Ad-TOPK+HG+Sevo-PostC組與Ad-vector+HG