TGF-β1對(duì)人軟骨細(xì)胞肥大化的影響研究.pdf

1、【目的】：
　　研究體外培養(yǎng)下不同濃度轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β1）刺激不同時(shí)間對(duì)人軟骨細(xì)胞肥大化的影響。
　　【方法】：
　　從正常人膝關(guān)節(jié)軟骨分離培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)建立軟骨細(xì)胞去分化模型，體外培養(yǎng)條件下不同濃度TGF-β1(5ng/mL、15ng/mL、25ng/mL)分別刺激P2代軟骨細(xì)胞6h、12h、24h，DMSO作為對(duì)照組。倒置顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞形態(tài)變化，甲苯胺藍(lán)染色鑒定軟骨細(xì)胞，提取 RNA，硝酸

2、還原酶法（逆轉(zhuǎn)錄試劑盒）合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)PTHrP、COL-10A1、Ihh的mRNA表達(dá)水平，提取樣本總蛋白進(jìn)行蛋白組學(xué)分析，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　經(jīng)SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間對(duì)比P<0.05，表明空白組、實(shí)驗(yàn)組不同軟骨刺激方式效果的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　【結(jié)果】：
　　原代軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)情況：剛接種的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞懸浮狀態(tài)，形態(tài)多為球形，12~24h后軟

3、骨細(xì)胞開始貼壁，形態(tài)由球型逐漸伸展成長(zhǎng)為三角形和多角形，進(jìn)而軟骨細(xì)胞間開始出現(xiàn)突起相連接，呈簇狀生長(zhǎng)。約5d軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，逐漸呈現(xiàn)“鋪路石”樣外觀，至14d時(shí)軟骨細(xì)胞貼壁已達(dá)90％。結(jié)合軟骨細(xì)胞取材部位和通過甲苯胺藍(lán)染色進(jìn)行鑒定，軟骨細(xì)胞內(nèi)見籃紫色異染顆粒，細(xì)胞周圍有少量異染顆粒出現(xiàn)，確定得到軟骨細(xì)胞。
　　表型觀察：TGF-β1刺激組：倒置顯微鏡下軟骨細(xì)胞呈集落生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)為梭形或多角形，較空白組對(duì)比，細(xì)胞體積變大，突起變

4、少；空白組：軟骨細(xì)胞呈集落生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)為梭形或多角形。
　　Real-time PCR結(jié)果：不同刺激條件下PTHrP、COL-10A1、Ihh mRNA的表達(dá)：PTHrP mRNA表達(dá)量較空白組降低，COL-10A1、Ihh mRNA的表達(dá)量較空白組升高；不同濃度TGF-β1刺激下，COL-10A1mRNA的表達(dá)量先呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，且濃度為15ng/mL時(shí)其表達(dá)量明顯高于另外兩個(gè)濃度；隨著時(shí)間的推移（6h、12h、24h

5、），COL-10A1mRNA的表達(dá)量逐漸減少。
　　蛋白組學(xué)分析：TGF-β1刺激軟骨細(xì)胞后，細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白表達(dá)改變，出現(xiàn)肥大化形態(tài)學(xué)改變，同時(shí)細(xì)胞調(diào)亡及死亡通路激活。
　　【結(jié)論】：
　　1、TGF-β1體外刺激人軟骨細(xì)胞后引起軟骨細(xì)胞肥大化指標(biāo)（促進(jìn)因子Ihh、肥大化特異性標(biāo)記物COL-10A1）的表達(dá)增加，而抑制因子PTHrP表達(dá)則減少，即對(duì)軟骨細(xì)胞有促進(jìn)肥大化作用；
　　2、隨著TGF-β1刺激濃度的升