探究顆粒蛋白前體在細(xì)菌性腦膜炎發(fā)病中的作用.pdf

1、目的：細(xì)菌性腦膜炎是兒童中發(fā)病率和死亡率都很高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌和腦膜炎奈瑟菌是引起該病的三大病原菌。此外，細(xì)菌性腦膜炎患者中大約有1/3會(huì)出現(xiàn)認(rèn)識(shí)障礙、聽力喪失、神經(jīng)組織壞死性病灶等嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。細(xì)菌性腦膜炎的確切病因和發(fā)病機(jī)制至今尚不清楚，這是目前難以有效控制該疾病的根本原因。因此，有必要深入探索其致病分子機(jī)制。顆粒蛋白前體（Progranulin, PGRN）既是分泌性生長(zhǎng)因子又是多功能免疫

2、調(diào)節(jié)因子，近期的研究顯示其在感染性疾病、傷口愈合、腫瘤發(fā)生、神經(jīng)增殖以及退行性疾病中都有重要作用。顆粒蛋白前體作為腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor, TNFR）的一種新配體，能通過(guò)拮抗TNF-α信號(hào)通路在炎性腸病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮抑炎作用。但其在在肥胖和胰島素抵抗性糖尿病中卻通過(guò)調(diào)節(jié)IL-6而發(fā)揮促炎作用。而顆粒蛋白前體在細(xì)菌性腦膜炎中的作用至今尚不清楚。因此，本研究擬比較顆粒蛋白前體在細(xì)

3、菌性腦膜炎病人和小鼠疾病模型中的表達(dá)差異，并觀察顆粒蛋白前體缺陷后小鼠感染肺炎鏈球菌性腦膜炎的癥狀、炎癥反應(yīng)、細(xì)菌載量及生存率等變化，初步探究顆粒蛋白前體在細(xì)菌性腦膜炎發(fā)病中的作用。
　　方法：收集臨床標(biāo)本：收集22例通過(guò)腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性和臨床診斷確診的細(xì)菌性腦膜炎患者、12例通過(guò)腦脊液病毒IgM陽(yáng)性和臨床診斷確診為病毒性腦膜炎患者以及10例非腦膜炎者的血漿和腦脊液，并收集其相關(guān)臨床資料。檢測(cè)患者血漿和腦脊液中顆粒蛋白前體的表達(dá)

4、：以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）檢測(cè)非腦膜炎者、細(xì)菌性腦膜炎患者、病毒性腦膜炎患者中血漿和腦脊液中顆粒蛋白前體的含量。構(gòu)建肺炎鏈球菌腦膜炎小鼠模型：選擇8-10周齡的健康C57BL/6小鼠，雌雄各半，直接注射15μl標(biāo)準(zhǔn)Ⅲ型肺炎鏈球菌菌株懸液（含菌量為4.5×106CFU）到小鼠的側(cè)腦室構(gòu)建肺炎鏈球菌腦膜炎小鼠模型，注射等體積的生理鹽水作為對(duì)照組，用常用的模型評(píng)價(jià)指

5、標(biāo)進(jìn)行評(píng)估。檢測(cè)細(xì)菌性腦膜炎小鼠模型中顆粒蛋白前體的表達(dá)：以免疫組織化學(xué)染色法和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)對(duì)照組和肺炎鏈球菌腦膜炎小鼠腦組織和血漿中顆粒蛋白前體的蛋白水平。探究顆粒蛋白前體在細(xì)菌腦膜炎中的作用：選擇體重，大小，性別一致的顆粒蛋白前體缺陷小鼠和野生小鼠，直接注射15μl標(biāo)準(zhǔn)Ⅲ型肺炎鏈球菌菌株懸液（含菌量為4.5×106CFU）到小鼠的側(cè)腦室后，評(píng)估其臨床癥狀的嚴(yán)重度、生存率、細(xì)菌載量、大腦炎癥水平。
　　結(jié)果：細(xì)菌性腦

6、膜炎患者血漿中的顆粒蛋白前體濃度雖然沒(méi)有較病毒性腦膜炎無(wú)明顯升高，卻較非腦膜炎組顯著升高（P<0.05）。但是在腦脊液中，細(xì)菌性腦膜炎患者和病毒性腦膜炎患者腦脊液中顆粒蛋白前體的蛋白濃度較非腦膜炎者表達(dá)都明顯升高（P<0.001），其中在細(xì)菌性腦膜炎患者中升高又比病毒性腦膜炎患者明顯（P<0.01）。此外，腦脊液中顆粒蛋白前體的含量與腦脊液中有核細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)（ rs=0.56, P<0.01），與腦脊液中蛋白含量呈顯著正相關(guān)（ rs

7、=0.87, P<0.001)，卻與腦脊液中葡萄糖的含量呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.44, P<0.001）。這些結(jié)果提示，腦脊液中顆粒蛋白前體的濃度可能具有鑒別診斷細(xì)菌性腦膜炎、病毒性腦膜炎以及非腦膜炎的能力。直接在野生C57BL/6小鼠側(cè)腦室注射15μl標(biāo)準(zhǔn)Ⅲ型肺炎鏈球菌菌株懸液（含菌量為4.5×106 CFU），24小時(shí)后，小鼠出現(xiàn)典型的腦膜炎癥狀：翻身障礙，動(dòng)作遲緩，毛發(fā)散、活動(dòng)性差、嗜睡。取小鼠腦組織切片進(jìn)行H&E染色，結(jié)果顯示，注

8、射肺炎鏈球菌的小鼠腦組織蛛網(wǎng)膜下腔出現(xiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，較無(wú)感染小鼠顯著增多，其蛛網(wǎng)膜或者軟腦膜損傷也較無(wú)感染小鼠更為嚴(yán)重。取血或者腦組織勻漿測(cè)定炎癥因子，結(jié)果顯示注射肺炎鏈球菌小鼠的TNF-α、IL-6、IL-1β較無(wú)感染小鼠的明顯升高（P<0.05）。以上結(jié)果顯示肺炎鏈球菌腦膜炎小鼠模型構(gòu)建成功。取小鼠腦組織切片進(jìn)行免疫組化染色，取血漿用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顆粒蛋白前體的表達(dá)。結(jié)果顯示相比對(duì)照組小鼠，肺炎鏈球菌腦膜炎小鼠的腦組織和

9、血漿中的顆粒蛋白前體表達(dá)顯著升高（P<0.05）。將顆粒蛋白前體缺陷小鼠經(jīng)側(cè)腦室直接注射15μl標(biāo)準(zhǔn)Ⅲ型肺炎鏈球菌菌株懸液（含菌量為4.5×106 CFU）后，觀察其臨床癥狀、生存率、細(xì)菌載量及腦組織炎癥。結(jié)果顯示，顆粒蛋白前體缺陷小鼠腦部感染肺炎鏈球菌后，其腦膜炎的臨床癥狀較野生小鼠更為嚴(yán)重，生存率更低（P<0.01），腦勻漿細(xì)菌載量更高（P<0.05），蛛網(wǎng)膜下腔及海馬區(qū)周圍更多的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　結(jié)論：顆粒蛋白前體參與了細(xì)