肝細胞癌中轉錄抑制因子ZHX2靶基因的分析研究.pdf

1、肝癌是全世界癌癥死亡的重要原因。其發(fā)病率和死亡率一直位居于惡性腫瘤前列。肝癌往往在中晚期才被確診，而且病情進展迅速，常常失去了有效的治療機會。肝癌的治療手段一般包括手術、放療、化療和綜合治療等。現(xiàn)在的治療方式多采用手術切除，但是術后復發(fā)率很高。分子靶向治療是新興的治療手段，靶向藥物能夠提高肝癌的治療效果，但是長遠生存率仍然改觀不大，而且靶向藥物受益人群有限。因此，為肝癌的診斷和治療尋求有效的新靶標是勢在必行的。
　　目的:

2、　　轉錄抑制因子ZHX2作為ZHX蛋白家族成員之一，在人體內廣泛存在，不僅在體內各種組織中有表達，而且對多種疾病中的關鍵基因表達具有調控作用。本課題組前期研究表明，ZHX2在肝癌組織和肝癌細胞系中低表達，提示可能為肝癌的抑制因子并且發(fā)現(xiàn)在肝癌組織和細胞系中發(fā)現(xiàn)ZHX2可以和細胞因子NF-YA結合調控下游基因的表達，從而抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展。國內外多項研究報道ZHX2可以影響其他基因對肝癌發(fā)生發(fā)展的調控，但是具體調控機制仍不明確。因此，針對

3、肝癌中轉錄抑制因子ZHX2調控的機制進行初步探討研究。分析肝細胞癌中轉錄抑制因子ZHX2轉錄調控特征，獲得ZHX2的靶基因;研究ZHX2和其靶基因在肝細胞癌中的表達及其臨床病理特征的關系，探討ZHX2與靶基因間的調控關系。
　　方法:
　　首先采用RT-PCR方法檢測肝癌細胞株HepG2、SMM7721、Be17402和正常肝細胞株LO2中ZHX2 mRNA表達的情況。接著利用ZHX2抗體進行染色質免疫共沉淀(chromat

4、in immunoprecipitation，ChIP)實驗，將富集到的DNA樣品進行高通量測序，得到肝細胞肝癌中ZHX2潛在靶基因，然后利用生物信息學進行分析。最后通過免疫組織化學技術檢測ZHX2和得到的靶基因PTEN、P53在肝細胞癌組織中的表達，并分析它們與臨床病理學特征的關系。
　　結果:
　　ZHX2 mRNA在3種肝癌細胞株中均有表達。對ChIP富集得到的DNA進行分析，共得到1981個ZHX2結合位點的peak

5、s，含有3093個結合的基因。ZHX2的peaks主要分布在1、2、3、5、7號染色體，在基因元件上的分布主要在基因間區(qū)、內含子區(qū)、轉錄起始位點上游和啟動子區(qū)。對ZHX2結合在啟動子區(qū)的232個基因進行基因功能(gene ontology，GO)注釋，發(fā)現(xiàn)ZHX2參與了與生物調節(jié)、代謝進程和分子調節(jié)功能等有關的生物功能，和形成血液微粒、近心異染色質等有關的細胞組分，在分子功能上與GTP酶的激活、調節(jié)和其他酶的激活有關的過程。然后進行KE

6、GGpathway分析顯示其中一些靶基因可能富集于4條通路，分別是3條傳染性疾病的通路和1條吞噬通路。相對于肝癌癌旁組織，ZHX2在肝細胞癌組織中低表達(P=0.042)，與血清AFP值相關(P=0.041); PTEN在癌組織中低表達(P=0.000)，分別與腫瘤的分化程度和血清AFP值有關(P=0.025，P=0.028);P53在癌組織中高表達(P=0.000)，與腫瘤的分化程度有關(P=0.045)。ZHX2與PTEN存在相關性

7、(r=0.258，P=0.031)。
　　結論:
　　本研究是首次采用ChIP-Seq技術從全基因組水平解析ZHX2在肝癌中的轉錄調控的靶基因。發(fā)現(xiàn)ZHX2除了與啟動子區(qū)域結合外，還可以和基因間區(qū)的遠距離調控區(qū)域結合調控靶基因。對啟動子區(qū)域的靶基因進行基因富集分析顯示結合的靶基因與代謝過程、生物調控過程等有關;富集通路分析提示富集靶基因可能影響了傳染性疾病和吞噬相關調控。
　　ZHX2與PTEN、P53在肝細胞癌發(fā)生發(fā)