基于液滴懸掛方法的體外三維胰島微組織構(gòu)建研究.pdf

1、背景：
　　糖尿病是世界上主要的慢性疾病之一，給人類健康帶來了沉重的負擔。而糖尿病主要的發(fā)病機制之一是胰島功能障礙，所以有關(guān)胰島的糖尿病研究已成為世界各醫(yī)學研究院的一個熱點問題。目前，研究糖尿病的常規(guī)體外實驗?zāi)Ｊ绞菃螌蛹毎囵B(yǎng)，但它不能再現(xiàn)體內(nèi)的三維組織結(jié)構(gòu)。隨著微-納米技術(shù)的發(fā)展，利用一些組織工程的方法構(gòu)建的體外三維胰島模型可更好地模擬體內(nèi)胰腺的胰島。體外三維胰島模型可比傳統(tǒng)的單層細胞培養(yǎng)具有更佳的細胞功能，在生理或病理條件下都

2、能夠作為實驗平臺，更好的觀察胰島行為，在研究糖尿病的分子機制和臨床胰島移植等方面具有潛在的應(yīng)用前景。近年來，多項研究利用組織工程方法探索構(gòu)建體外三維胰島模型，但采用液滴懸掛法構(gòu)建體外三維胰島模型并將其與二維單層細胞和原代胰島進行形態(tài)與功能方面對比的研究較少。本課題將利用液滴懸掛法構(gòu)建體外三維β細胞球微組織作為體外三維胰島模型，對這一問題進行探討。
　　目的：
　　1.采用液滴懸掛法探索構(gòu)建適宜大小體外三維胰島微組織。

3、　　2.從形態(tài)和功能兩個方面對所構(gòu)建的體外三維胰島微組織和二維β細胞進行對比。
　　3.從形態(tài)和功能兩個方面對所構(gòu)建的體外三維胰島微組織和原代胰島進行對比。
　　方法：
　　1.制備液滴懸掛板，培養(yǎng)β細胞，根據(jù)不同條件，探索制備適宜形態(tài)大小的體外三維胰島微組織的條件，成功制備后，運用細胞活性鑒定試劑盒鑒定其活性。
　　2.采用倒置顯微鏡和免疫熒光技術(shù)觀察體外三維胰島微組織和二維β細胞形態(tài)上的異同，采用葡萄糖刺激胰

4、島素釋放實驗觀察體外三維胰島微組織和二維β細胞功能上的異同。
　　3.提取大鼠原代胰島，建立原代胰島模型，采用倒置顯微鏡、免疫熒光技術(shù)和電鏡技術(shù)觀察體外三維胰島微組織和原代胰島形態(tài)上的異同，采用葡萄糖刺激胰島素釋放實驗觀察體外三維胰島微組織和原代胰島功能上的異同。
　　結(jié)果：
　　1.采用液滴懸掛法構(gòu)建適宜形態(tài)大小體外三維胰島微組織的條件是用密度105個/mlβ細胞液滴30μl鋪展為直徑5 mm的懸滴。
　　2.

5、體外三維胰島微組織培養(yǎng)7天后，絕大部分細胞活性良好。
　　3.體外三維胰島微組織與二維β細胞在形態(tài)學上相比，體外三維胰島微組織中β細胞聚集成球形、橢球形或不規(guī)則形的立體結(jié)構(gòu),直徑大小約100-200μm，細胞與細胞之間排列緊密；免疫熒光實驗顯示，體外三維胰島微組織表達豐富的胰島素。
　　4.在功能上進行對比，體外三維胰島微組織胰島素釋放指數(shù)（2.08±0.14）高于二維β細胞胰島素釋放指數(shù)（1.49±0.21）（P<0.05

6、）。
　　5.體外三維胰島微組織和原代胰島在形態(tài)學上進行對比，原代胰島呈球形、橢球形或不規(guī)則形立體結(jié)構(gòu),直徑大小約100-200μm，細胞與細胞之間排列緊密，原代胰島外表面光滑，有一層膜包裹；體外三維胰島微組織形態(tài)大小和原代胰島類似，但沒有包膜包裹，細胞裸露在表面。免疫熒光實驗顯示，體外三維胰島微組織的β細胞分布和胰島素的表達量與原代胰島類似。
　　6.在功能上進行對比，三維胰島微組織胰島素釋放指數(shù)（2.08±0.14）低于

7、原代胰島胰島素釋放指數(shù)（2.72±0.31）（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.通過探索實驗條件，采用液滴懸掛法可以構(gòu)建適宜形態(tài)大小且活性良好的體外三維胰島微組織。
　　2.體外三維胰島微組織與二維β細胞在形態(tài)學上相比，體外三維胰島微組織為立體結(jié)構(gòu)；功能上相比，體外三維胰島微組織的胰島素分泌功能優(yōu)于二維β細胞。
　　3.體外三維胰島微組織與原代胰島在形態(tài)學上相比，體外三維胰島微組織與原代胰島類似；功能上相比，