鐵自噬促Sideroflexin1依賴性線粒體鐵超載介導apelin-13誘導心肌細胞肥大.pdf

1、目的：Apelin是G蛋白偶聯(lián)受體APJ的內(nèi)源性配體，在心血管系統(tǒng)形成及相關疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。本實驗室前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，apelin-13具有誘導心肌細胞肥大的作用，且自噬途徑參與了apelin-13誘導的心肌細胞肥大過程。鐵自噬(Ferritinophagy)是最新發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鐵代謝的選擇性自噬。過度激活鐵自噬可能誘導細胞內(nèi)鐵超載從而參與心肌肥厚的發(fā)展。本課題擬研究apelin-13對鐵自噬及線粒體鐵代謝的影響，并

2、在前期研究的基礎上探討鐵自噬-線粒體鐵離子轉(zhuǎn)運蛋白Sideroflexin1(SFXN1)依賴性線粒體鐵超載介導apelin-13促心肌細胞肥大的新機制，揭示apelin-13/APJ系統(tǒng)誘導心肌肥厚的新的作用機制，為開發(fā)以APJ為靶點的抗心肌肥厚藥物提供新的實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1、Western Blot：檢測大鼠H9c2心肌細胞NCOA4,FTH1,SFXN1,TRC40,Tom7,Tom70,DMT1,BNP,

3、LC3II/I的表達；
　　2、分離線粒體并應用WB檢測線粒體蛋白的表達;
　　3、RNA干擾:設計RNA干擾鏈分別干擾H9c2心肌細胞中NCOA4，TRC40，Tom7，SFXN1的表達；
　　4、普魯士藍染色法(Prussian blue staining)觀察H9c2心肌細胞及心肌組織中鐵沉積；
　　5、鈣黃綠素(Calcein–AM)熒光探針檢測H9c2心肌細胞中游離鐵的變化；
　　6、流式細胞術檢

4、測H9c2心肌細胞中線粒體螯合鐵的含量；
　　7、RPA熒光探針觀察H9c2心肌細胞中線粒體螯合鐵的含量；
　　8、Mito-SOX熒光探針檢測H9c2細胞中線粒體ROS的生成；
　　9、免疫熒光觀察NCOA4和LC3B共定位；
　　10、ScepterTM手持細胞計數(shù)器測量H9c2心肌細胞的直徑和體積；
　　11、BCA試劑盒測定H9c2心肌細胞中的蛋白含量；
　　12、免疫組化觀察人尸檢心肌肥厚心

5、臟組織標本和雙腎雙夾大鼠腎血管性高血壓模型大鼠心臟組織中apelin,BNP,NCOA4,SFXN1蛋白的表達；
　　結(jié)果：
　　1、Apelin-13增加H9c2心肌細胞內(nèi)游離鐵含量，且進一步促進鐵負載劑-枸櫞酸鐵（FAC）誘導的游離鐵的增加；apelin-13誘導H9c2心肌細胞內(nèi)鐵沉積，且進一步促進鐵劑FAC誘導的鐵沉積；
　　2、Apelin-13以劑量(0-1μmol/L)及時間(0-24h)依賴性抑制H9c

6、2細胞中鐵自噬底物鐵蛋白(FTH1)的表達，促進鐵自噬貨物受體NCOA4的表達；APJ拮抗劑F13A(1μmol/L,24h)阻斷apelin-13(0.1μmol/L,24h)對FTH1和NCOA4的作用；apelin-13促進NCOA4與GFP-LC3B融合；自噬體降解抑制劑羥基氯喹（HCQ）阻斷了apelin-13對FTH1的降解作用，進一步促進了apelin-13對NCOA4的表達；apelin-13進一步增強鐵負載劑-枸櫞酸鐵

7、（FAC）誘導的鐵自噬；
　　3、NCOA4-siRNA抑制apelin-13(0.1μmol/L,48h)誘導的H9c2心肌細胞內(nèi)游離鐵的增加；
　　4、Apelin-13(0.1μmol/L,48h)促進線粒體鐵超載; apelin-13(0.1μmol/L,6h)促進線粒體ROS增加；透射電子顯微鏡下觀察到apelin-13(0.1μmol/L,12h)引起H9c2心肌細胞線粒體腫脹及空泡化；
　　5、Apeli

8、n-13以劑量(0-1μmol/L)和時間(0-24h)依賴性促進H9c2心肌細胞中線粒體轉(zhuǎn)鐵蛋白SFXN1的表達；APJ拮抗劑F13A(1μmol/L,24h)阻斷了apelin-13(0.1μmol/L,24h)對SFXN1的作用；
　　6、NCOA4-siRNA抑制apelin-13誘導的SFXN1的表達；
　　7、SFXN1-siRNA抑制apelin-13誘導的線粒體鐵超載以及線粒體ROS的生成；
　　8、A

9、pelin-13以劑量(0-1μmol/L)以及時間(0-24h)依賴性促進H9c2心肌細胞中線粒體外膜轉(zhuǎn)運酶Tom7,Tom70的表達；APJ拮抗劑F13A(1μmol/L,24h)阻斷了apelin-13(0.1μmol/L,24h)對Tom7,Tom70的誘導作用；Apelin-13促進Tom7錨定于線粒體；
　　9、Tom7-siRNA抑制apelin-13誘導的SFXN1的表達；
　　10、Apelin-13以劑量

10、(0-1μmol/L)和時間(0-24h)依賴性促進H9c2細胞中尾錨蛋白識別因子TRC40的表達；APJ拮抗劑F13A(1μmol/L,24h)阻斷了apelin-13(0.1μmol/L,24h)對TRC40的作用；
　　11、TRC40-siRNA抑制apelin-13誘導的Tom7,SFXN1的表達；
　　12、Apelin-13促進鐵離子轉(zhuǎn)運體-二價金屬離子轉(zhuǎn)運體(DMT1)的表達，且被APJ拮抗劑F13A抑制；<

11、br>　　13、Apelin-13促進H9c2心肌細胞直徑、體積增大和細胞內(nèi)蛋白含量增加；apelin-13促進心肌肥大因子BNP的表達，且被F13A抑制；
　　14、NCOA4-siRNA抑制apelin-13誘導的H9c2心肌細胞直徑、體積增大以及心肌肥大因子BNP表達；SFXN1-siRNA抑制apelin-13誘導H9c2心肌細胞直徑、體積增大以及心肌肥大因子BNP表達；Tom7-siRNA，TRC40-siRNA抑制ap