納米熒光探針用于細(xì)胞和活體中活性小分子和miRNA的高靈敏檢測與成像.pdf

1、細(xì)胞內(nèi)的活性分子是細(xì)胞的重要組成成分，它主要分為兩類：活性小分子和活性大分子?；钚孕》肿又饕ɑ钚匝踝杂苫?、活性氮自由基、氣體小分子（CO、NO、H2S、O2等）、抗氧化劑（谷胱甘肽和維生素C等）、H+、金屬陽離子、陰離子等；活性大分子包括蛋白質(zhì)和核苷酸等。這些活性分子在生物體的生命活動中起著至關(guān)重要的作用，是活細(xì)胞生理功能必不可少的物質(zhì)。目前，細(xì)胞內(nèi)活性分子的檢測受到廣泛關(guān)注且被大量研究，但是仍然存在檢測限高，靈敏度低，選擇性差的缺

2、點，這將極大地限制我們準(zhǔn)確探究活性分子在細(xì)胞生理病理活動中所起的作用，無法對其功能做出準(zhǔn)確判斷。因此發(fā)展高靈敏度和高選擇性的分析方法來實現(xiàn)對它們的檢測具有重要意義。
　　DNA納米技術(shù)是近幾十年發(fā)展起來的一種以脫氧核糖核酸為結(jié)構(gòu)單元，建造納米尺寸結(jié)構(gòu)的一門技術(shù)。DNA除了作為基因的載體，本身還是一種一維的納米線，能通過組裝構(gòu)建二維平面、三維管狀和多面體等多種結(jié)構(gòu)，在這些三維結(jié)構(gòu)中，DNA四面體結(jié)構(gòu)由于合成簡單，易于修飾等優(yōu)點已經(jīng)在

3、生物傳感和治療方面得到了廣泛的應(yīng)用。DNA四面體由六條邊和四個頂點組成，每條邊和每個頂點都能進行功能化修飾染料或其他核苷酸，而且四面體的結(jié)構(gòu)具有易于進細(xì)胞，良好的生物相容性，高的核酸酶穩(wěn)定性等特點，使其在生物研究中得到了廣泛的應(yīng)用。
　　氧化石墨烯（GO）納米片是二維單層具有 sp2碳層結(jié)構(gòu)的材料，具有良好的水溶性、兩親性和生物相容性，能將某些含芳香基團的疏水分子通過π?π堆積和氫鍵相互作用吸附到其表面。氧化石墨烯的表面能功能修飾

4、羥基、羧基、氨基等活性官能團，為進一步修飾其他功能性物質(zhì)提供可能。GO具有寬的吸收帶，因此能作為良好的熒光猝滅劑，使得吸附在其表面的染料分子的熒光被猝滅，而且其尺寸在納米級別，能作為良好的載體將攜帶的物質(zhì)運送到細(xì)胞內(nèi)。
　　本論文分別以DNA四面體和GO作為載體，設(shè)計合成了兩種納米熒光探針，用于細(xì)胞和活體內(nèi)活性小分子和microRNA(miRNA)的高靈敏檢測。本論文主要從以下兩方面的工作開展：
　　1、基于 DNA四面體控

5、制染料距離避免自猝滅，實現(xiàn)細(xì)胞和活體內(nèi)多組分的高靈敏檢測。目前發(fā)展的多組分的檢測方法會引起染料探針的熒光自猝滅從而降低檢測的靈敏度。為了解決這個問題，我們設(shè)計了一種基于DNA四面體控制染料距離的納米探針，實現(xiàn)了在同一激發(fā)下對pH和超氧（O2??）的高靈敏檢測。DNA四面體是由四條等長的單鏈經(jīng)過淬火過程組裝形成的，在DNA四面體的一個頂點處修飾熒光素，在其他三個頂點處修飾二氫乙錠。熒光素和二氫乙錠分別作為pH和O2??的響應(yīng)基團，它們具有

6、相同的激發(fā)波長（488 nm）和不同的發(fā)射波長（515 nm和580 nm）。由于兩個染料分別修飾在四面體的頂點處，它們之間的距離得到了有效的控制，對比基于介孔硅裝載染料檢測的方法，該方法降低了熒光自猝滅的效率。實驗證明DNA四面體有良好的生物相容性，能攜帶染料進入細(xì)胞和強的抗核酸酶的降解的能力，實現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)pH和O2??的高靈敏檢測。將該探針應(yīng)用于活體炎癥模型時，觀察到炎癥區(qū)域pH的下調(diào)和O2??的上調(diào)過程。該方法可通過控制染料距離有

7、效降低自猝滅效率，提高靈敏度，為多組分的檢測提供了新的可能。
　　2、基于石墨烯（GO）和分子信標(biāo)（MB）的納米探針用于細(xì)胞和活體內(nèi)miRNA的高靈敏檢測與成像。在 MB的兩端分別修飾兩個染料分子，由于它們之間距離近而發(fā)生熒光自猝滅，當(dāng) MB吸附到 GO上，染料分子的熒光被進一步猝滅，相比于 MB上連接一個染料的對比組，納米探針有效的降低了熒光背景；當(dāng)遇到靶分子miRNA時，納米探針能實現(xiàn)兩分子的熒光恢復(fù)，而對比組只能實現(xiàn)一分子的