泛發(fā)性膿皰型銀屑病患者DNA甲基化相關(guān)研究及臨床分析.pdf

1、泛發(fā)性膿皰型銀屑病(generalized pustular psoriasis，GPP)是一種系統(tǒng)性炎癥性皮膚病，嚴(yán)重時(shí)可威脅生命。GPP發(fā)病率較低，但發(fā)病時(shí)常常伴有高熱及全身不適，嚴(yán)重時(shí)可威脅生命。因而GPP相關(guān)的病因及發(fā)病機(jī)制研究一直為皮膚科領(lǐng)域的熱點(diǎn)。目前為止，隨著關(guān)于GPP遺傳背景研究的開(kāi)展，IL36RN和CARD14兩個(gè)基因逐漸被認(rèn)為是GPP的致病易感基因。但是一些臨床現(xiàn)象仍然無(wú)法解釋，如大多數(shù)單獨(dú)發(fā)生的GPP是由IL36R

2、N基因的純合或復(fù)合雜合突變引起的，但人群中也有正常個(gè)體攜帶IL36RN基因突變;為何感染、妊娠和特殊藥物應(yīng)用等狀態(tài)能誘發(fā)GPP的發(fā)作。因此易感基因遺傳方式雖然解釋了一部分GPP病人的發(fā)病，但無(wú)法全面揭示性別、年齡及誘因等非遺傳方式對(duì)疾病發(fā)生發(fā)展的影響，例如為何感染、妊娠和特殊藥物應(yīng)用等狀態(tài)能誘發(fā)GPP的發(fā)作。表觀遺傳學(xué)是指在研究基因的核苷酸序列未發(fā)生改變的情況下，對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。這種調(diào)節(jié)可遺傳給后代并為可逆性的基因表達(dá)調(diào)節(jié)。有研究

3、表明，表觀遺傳調(diào)控機(jī)制在系統(tǒng)紅斑狼瘡等自身免疫性疾病中發(fā)揮重要的作用，但有關(guān)GPP的表觀遺傳學(xué)的研究較少。我們課題組在之前的前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)GPP患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中存在異常的DNA甲基化狀態(tài)改變，這表明DNA甲基化可能是參與GPP發(fā)病的重要機(jī)制之一。
　　DNA甲基化是指在甲基化酶的催化作用下，以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethione，SAM)為甲基供體，將甲基（-CH3）添加至胞嘧啶第五位碳原子上，生成5-甲基

4、胞嘧啶(5mC)的生物學(xué)過(guò)程。因此，本課題擬首次對(duì)GPP患者及正常人的外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)進(jìn)行全基因組DNA甲基化測(cè)序及相關(guān)研究，以全面揭示甲基化改變?cè)贕PP的發(fā)生發(fā)展中的作用，填補(bǔ)相關(guān)領(lǐng)域的空白。
　　第一部分 泛發(fā)性膿皰型銀屑病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞DNA甲基化測(cè)序
　　目的：研究GPP患者及正常健康人PBMC的全基因組DNA甲基化狀態(tài)，探討DNA

5、甲基化在GPP患者中的表達(dá)差異。
　　方法：提取3例GPP患者和3例正常健康人的PBMC中的基因組DNA，并采用Illumina Human Methylation450K BeadChip芯片技術(shù)對(duì)其進(jìn)行DNA甲基化測(cè)序。
　　結(jié)果：通過(guò)Illumina Human Methylation450K BeadChip芯片測(cè)序，我們得到了足夠測(cè)序深度和分辨率的全基因組甲基化圖譜。甲基化發(fā)生異常變化的差異甲基化區(qū)域達(dá)到6328個(gè)

6、。和正常健康人的PBMC相比，GPP的PBMC全基因組DNA呈現(xiàn)異常甲基化狀態(tài)，其中甲基化程度升高位點(diǎn)5921個(gè)，甲基化程度降低位點(diǎn)407個(gè)。2例同為妊娠狀態(tài)下誘導(dǎo)的GPP患者，在主要成分分析中分布更為接近。GO分析顯示甲基化明顯異常改變的基因類型包括免疫細(xì)胞遷移、炎癥反應(yīng)及信號(hào)傳導(dǎo)等。
　　結(jié)論：GPP患者PBMC中基因組DNA較正常健康人發(fā)生異常的甲基化狀態(tài)，其中眾多甲基化水平差異表達(dá)的基因與病理生理過(guò)程相關(guān)，功能涉及多個(gè)方面

7、，信號(hào)通路極其復(fù)雜;妊娠可能通過(guò)改變機(jī)體內(nèi)甲基化水平的狀態(tài)影響疾病的發(fā)生。
　　第二部分 泛發(fā)性膿皰型銀屑病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞PDCD1基因調(diào)控序列甲基化水平及調(diào)控因子研究
　　目的：選擇細(xì)胞程序性死亡受體1(programmed cell death1，PDCD1)基因?qū)PP患者PBMC的DNA甲基化測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)研究GPP患者的PBMC的甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)及甲

8、基化CpG結(jié)合蛋白(Methyl-CpG binding proteins，MBD)的表達(dá)。
　　方法：選取9例GPP患者及10例健康正常人的PBMC為研究對(duì)象，采用飛行質(zhì)譜法對(duì)PDCD1基因甲基化進(jìn)行測(cè)序，以驗(yàn)證甲基化芯片的結(jié)果。同時(shí)采用Trizol法提取9例GPP患者及10例健康正常人的PBMC中的總RNA，應(yīng)用Real-time PCR的方法檢測(cè)PDCD1、DNMT及MBD蛋白的mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：與正常健康

9、人PBMC相比，GPP患者的PBMC中的PDCD1基因呈高甲基化狀態(tài)。PDCD1的mRNA表達(dá)水平顯著降低，且與甲基化水平呈負(fù)相關(guān)。與正常對(duì)照組相比，GPP患者的PBMC中DNMT3a、DNMT3b、MBD1、MBD2、MBD4及MBD5較對(duì)照組水平升高，而DNMT1、MBD3水平較對(duì)照組降低。
　　結(jié)論：GPP患者的PBMC中基因PDCD1的甲基化飛行質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果與全基因組DNA甲基化芯片測(cè)序結(jié)果一致，且PDCD1 mRNA表達(dá)

10、水平異常;GPP患者體內(nèi)甲基化相關(guān)調(diào)控基因異常表達(dá)，這為甲基化在GPP發(fā)病中的作用及機(jī)制提供了重要的依據(jù)，為GPP的治療提供了新的線索。
　　第三部分 泛發(fā)性膿皰型銀屑病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞PDCD1下游因子相關(guān)表達(dá)研究
　　目的：為了進(jìn)一步明確PDCD1在GPP發(fā)生發(fā)展中扮演的角色，本部分對(duì)PDCD1的配體及信號(hào)通路中NF-κ B在GPP患者的PBMC中的表達(dá)量進(jìn)行研究，并且檢測(cè)了下游IL-17、IL-22及IL-4的含量

11、。
　　方法：采用Trizol法提取9例GPP患者及10例健康正常人的PBMC中的總RNA，應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)PDCD1的配體細(xì)胞程序性死亡受體配體1（programmed cell death ligand1，PDL1）及細(xì)胞程序性死亡受體配體2(programmed cell death ligand2，PDL2)的mRNA表達(dá)水平。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent

12、assay，ElISA)對(duì)23例GPP患者及24例健康正常人的外周血血清進(jìn)行IL-17、IL-22及IL-4的含量檢測(cè)。
　　結(jié)果：與正常健康人相比，GPP患者的PBMC中PDL1及PDL2表達(dá)上調(diào)，且IL-17、IL-22及IL-4的濃度顯著上升。
　　結(jié)論：PDCD1及其配體途徑在GPP患者體內(nèi)異常表達(dá)，可能在GPP的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色。
　　第四部分 IL36RN基因突變與泛發(fā)性膿皰型銀屑病患者臨床表現(xiàn)及治

13、療的聯(lián)系
　　目的：研究GPP患者中IL36RN突變與長(zhǎng)期隨訪的臨床表現(xiàn)、復(fù)發(fā)頻率及阿維A治療療效的關(guān)系。
　　方法：這項(xiàng)回顧性的研究納入61例GPP患者及48例尋常型銀屑病患者。并按照IL36RN突變類型將GPP患者分為純合突變組(homozygous mutation group，HOMG)25例，雜合突變組(heterozygous mutation group，HEMG)7例及無(wú)突變組(non-mutation gr

14、oup，NMG)29例。
　　結(jié)果：HOMG中21例患者初始表現(xiàn)為誘因誘發(fā)的GPP，其中13例在膿皰發(fā)作期后轉(zhuǎn)化為紅皮病;HEMG中的5例患者及NMG中的23例患者起病及膿皰發(fā)作期后均表現(xiàn)為PV。大多數(shù)患者對(duì)阿維A治療反應(yīng)較好。隨訪過(guò)程中部分患者在阿維A維持劑量（10-30mg/d）下輕度復(fù)發(fā)（0-2次每年）。IL36RN突變與疾病的發(fā)病年齡及甲下膿皰相關(guān)，對(duì)阿維A的療效無(wú)明顯影響。
　　結(jié)論：IL36RN突變不是影響阿維A