新型磁感應熱療介質加熱誘導癌細胞凋亡的實驗探究及信號肽修飾磁性納米介質的應用.pdf

1、實驗背景:
　　慢性粒細胞白血病是常見的一種血液系統(tǒng)惡性癌癥，導致其愈后效果不好的一大因素是細胞對化療藥物的耐藥性。目前，尋求新型治療技術是該疾病治療的重點發(fā)展方向。微納介質磁感應熱療技術可應用于血液腫瘤治療領域，并且能夠在體外很好的抑制人白血病細胞的生長，但其誘導凋亡產(chǎn)生的作用機制還不是特別清楚。
　　已知細胞穿膜肽可以攜帶Fe3O4納米粒子進入到細胞中，而線粒體跟細胞核又是細胞中非常重要的兩個細胞器，因此我們推測，將磁性

2、納米粒在線粒體和細胞核富集有利于增強磁感應熱療效果。我們將CPPs穿膜序列與線粒體和細胞核的定位序列相結合，設計出線粒體和細胞核靶向定位的多肽序列，引導磁性納米粒在細胞內(nèi)靶向定位。
　　實驗目的:
　　1.探討磁感應熱療技術誘導耐藥白血病K562/G細胞凋亡的可能性并探討其作用機制。
　　2.制備信號肽耦聯(lián)的磁性納米粒并在細胞水平探究該納米粒應用于磁感應熱療的安全性和有效性。
　　實驗方法:
　　1.應用耐

3、藥白血病K562/G細胞為實驗對象，以不銹鋼空心球為介質，300kHz，40Gs的磁場條件下43℃熱療30min，流式細胞儀檢測細胞的凋亡率，線粒體內(nèi)膜電位(△Ψm)的變化以及細胞周期的阻斷情況，探究K562/G死亡是否由凋亡引起;設置43℃，47℃，50℃對細胞進行磁感應熱療，采用比色法檢測Caspase-3，8，9的活性;Western blotting分析了Hsp70蛋白及β-catenin蛋白的表達情況;采用免疫熒光法比較Bax

4、/Bcl-2比值的變化。
　　2.設計合成RM，RN，TM以及購買魚精蛋白四種信號肽，共沉淀法合成Fe3O4納米粒，在其表面耦聯(lián)以上四種靶向多肽。采用透射電鏡、傅立葉紅外光譜儀、Zeta電位分析儀進行物理表觀的檢測，并繪制磁滯回線。細胞與0mg/mL，8mg/mL，16mg/mL，24mg/mL四種濃度的靶向Fe3O4納米粒共孵育，24h后MTT法檢測合成納米粒的細胞相容性，使用ICP光譜儀測定共孵育后細胞對納米粒的吞噬情況，共聚

5、焦顯微鏡確定粒子的靶向性，最后MTT法檢測相同溫度下信號肽修飾后的納米粒子體外升溫并抑制細胞增殖的情況。
　　實驗結果:
　　1.35、30、25、20、15mg/mL濃度的不銹鋼空心球在300kHz、40Gs的磁場下溫度升高情況隨濃度而增加。MTT法檢測空心球24h，48h，72h的細胞毒性較小，細胞相容性較好。細胞在交變磁場下加溫30min，43℃細胞的增殖率為73.46±2.60％，47℃細胞的增殖率為66.77±2.

6、34％，50℃細胞的增殖率為55.66±3.24％，磁感應熱療可以很好的殺死以及抑制K562/G細胞的增殖。流式細胞儀檢測43℃磁感應熱療30min后，K562/G的凋亡率達到了39％;線粒體膜電位發(fā)生去極化的細胞所占的比例由10.2％增加到了70.8％;細胞的周期被阻斷在G2/M期。磁感應熱療后第24h檢測Caspase3，8，9的酶活均顯著增強，并且隨著加熱溫度的升高，更多的Caspase3，8，9酶原被激活。經(jīng)磁熱療后K562/G

7、細胞Hsp70蛋白的表達升高并且隨著熱療溫度的升高表達增強，而β-catenin蛋白的表達相應降低。免疫熒光檢測Bax/Bcl-2的比率隨著熱療溫度的增加也逐漸增大。
　　2.使用沉淀法反應而成的Fe3O4，其外形近圓球形，直徑大約10nm左右，經(jīng)信號肽修飾后直徑大小和形態(tài)均保持良好;MTT法檢測其毒性較小，細胞相容性好;Zeta電位有所增加;磁飽和度下降;傅立葉紅外光譜儀結果顯示耦聯(lián)后粒子出現(xiàn)了Fe-O-Fe，Si-O，-CO-

8、NH-收縮震動峰，信號肽成功耦聯(lián)到了磁流體納米粒。ICP檢測結果表明耦聯(lián)信號肽后單個細胞中的Fe含量均明顯增加。激光共聚焦觀察帶綠色熒光的Fe3O4磁性納米粒在信號肽RM，TM的引導下能夠穿過細胞膜并在線粒體部位聚集，而RN-MNPs的靶向性不好。SW480細胞與Fe3O4磁性納米粒子在交變磁場下43℃加溫30min后，耦聯(lián)信號肽后的納米粒子對細胞的熱療效果得到了明顯增強，其中PRO-MNPs對細胞的效果最好，細胞的存活率僅為29.54