腦腸肽促進(jìn)小鼠異基因骨髓移植后胸腺再生的初步研究.pdf

1、目的:
　　異基因造血干細(xì)胞移植后胸腺萎縮及功能缺陷導(dǎo)致的免疫重建延遲，是導(dǎo)致移植后感染死亡和疾病復(fù)發(fā)的重要原因之一。如何促進(jìn)移植后受損胸腺再生及功能恢復(fù)是本領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。近年來(lái)，腦腸肽(Ghrelin，GRL)的免疫調(diào)節(jié)作用已越來(lái)越受到人們的重視，研究報(bào)道，GRL能逆轉(zhuǎn)老年鼠胸腺萎縮狀態(tài)，恢復(fù)年輕化。但GRL對(duì)造血干細(xì)胞移植后胸腺作用的相關(guān)研究仍不多。本研究通過(guò)構(gòu)建清髓性異基因骨髓造血干細(xì)胞移植模型，在清髓性全身照射和移植前后

2、不同時(shí)間點(diǎn)輸注GRL，初步探討GRL對(duì)移植后小鼠胸腺的再生作用。
　　方法:
　　1.建立清髓性異基因骨髓移植模型，供鼠為C57BL/6小鼠(H-2Kb)，受鼠為BALB/c小鼠(H-2Kd)。分別對(duì)全身照射(Total body irradiation，TBI)劑量(7.0Gy，7.5Gy，8.0Gy)和輸注骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMNCs)數(shù)量(0.5×107，1.0×107，2.0×107)進(jìn)行摸索。隨后觀察小鼠一般情況、G

3、VHD表現(xiàn)、植入情況。
　　2.為觀察腦腸肽對(duì)清髓性TBI后小鼠損傷胸腺作用，120只小鼠隨機(jī)分為4組，分別在TBI前7天(A1組)、TBI后1天(B1組)開始給予GRL或僅給予磷酸鹽溶液（C1組），直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，D1組作為正常對(duì)照，不做任何處理。分別于TBI后1、7、14天分批處死各組小鼠，取胸腺組織計(jì)算胸腺細(xì)胞總數(shù)、HE染色及免疫熒光標(biāo)記分析胸腺結(jié)構(gòu)變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)胸腺各亞群細(xì)胞亞群的比例。
　　3.為觀察GRL對(duì)骨

4、髓移植(Bone marrow transplantation，BMT)后小鼠胸腺再生作用，120只小鼠隨機(jī)分為4組，分別在BMT前7天(A2組)、BMT后1天(B2組)開始給予GRL或僅給予磷酸鹽溶液（C2組），直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，D2組作為正常對(duì)照，不做任何處理。分別于移植后14、21、28天分批處死各組小鼠，取胸腺組織計(jì)算胸腺細(xì)胞總數(shù)、HE染色及免疫熒光標(biāo)記分析胸腺結(jié)構(gòu)變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)胸腺各亞群細(xì)胞亞群的比例，用SYBR Green

5、Ⅰ法相對(duì)定量PCR檢測(cè)外周血sjTREC水平。
　　結(jié)果:
　　1.接受7.5GyTBI小鼠全部于30天內(nèi)死亡，且死亡前檢測(cè)白細(xì)胞數(shù)量均小于0.5×109/L，為造血衰竭狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)選用7.5Gy作為清髓性預(yù)處理方案。輸注0.5×107，1.0×107，2.0×107個(gè)BMNCs組小鼠均能長(zhǎng)期生存，但骨髓細(xì)胞植入分析結(jié)果顯示，0.5×107個(gè)，1.0×107個(gè)BMNCs小鼠為混合植入，輸注2.0×107個(gè)BMNCs小鼠為完全

6、植入。
　　2.GRL對(duì)TBI后小鼠胸腺作用:(1)胸腺結(jié)構(gòu)變化:GRL治療的小鼠胸腺上皮細(xì)胞變性壞死明顯減輕，在TBI后1天，給予GRL保護(hù)的A1組小鼠胸腺結(jié)構(gòu)仍保持正常皮髓交界，而C1組已出現(xiàn)明顯萎縮及細(xì)胞凋亡。(2)胸腺內(nèi)T細(xì)胞變化:與C1組相比，GRL治療胸腺各T淋巴細(xì)胞亞群失衡程度明顯減輕，且各組T淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)數(shù)較高。在移植前給予GRL的A1組尤為明顯，在TBI后14天，A1組及C1組CD4-CD8-、CD4+CD8

7、+、CD4+、CD8+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)分別為（5.08±0.48）×106vs(2.86±0.57)×106，(P＜0.05)、（3.62±0.69）×106vs(1.38±0.89)×106,(P＜0.05)、(0.65±0.08)×106vs(0.22±0.09)×106,(P＜0.05)、(0.55±0.30)×106vs(0.24±0.09)×106,(P＜0.05)。
　　3.GRL對(duì)BMT后小鼠胸腺作用:(1)胸腺結(jié)構(gòu)變化

8、:與C2組相比，GRL治療的小鼠胸腺結(jié)構(gòu)恢復(fù)迅速，胸腺細(xì)胞凋亡較少，在移植后28天，A2組小鼠結(jié)構(gòu)已基本恢復(fù)正常，且代表胸腺基質(zhì)祖細(xì)胞的K5+K8+細(xì)胞明顯較C2組增多。(2)胸腺內(nèi)T細(xì)胞變化:GRL治療小鼠胸腺各T淋巴細(xì)胞亞群失衡程度較C2組明顯較輕，未成熟雙陰細(xì)胞比例相對(duì)減少，雙陽(yáng)細(xì)胞比例明顯增高，且明顯提高胸腺內(nèi)發(fā)育成熟的CD4+細(xì)胞比例，但對(duì)CD8+細(xì)胞比例無(wú)明顯影響。移植后28天，A2及B2組CD4+絕對(duì)數(shù)分別為（9.51±1

9、.59）×106及（6.96±1.26）×106，均明顯高于C2組（4.90±1.80）×106(P＜0.05)。移植后21，28天A2組外周血TREC水平均明顯高于C2組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　GRL能在一定程度上保護(hù)小鼠胸腺免受移植前預(yù)處理?yè)p傷，增強(qiáng)胸腺對(duì)移植前預(yù)處理?yè)p傷抵抗，促進(jìn)損傷胸腺結(jié)構(gòu)的修復(fù)及胸腺細(xì)胞增殖并且能促進(jìn)未成熟T細(xì)胞從雙陰性向雙陽(yáng)性細(xì)胞分化，促進(jìn)向胸腺細(xì)胞向成熟CD4+T細(xì)胞分化，增強(qiáng)胸腺輸