硫化氫對小鼠原代肝細胞脂肪合成和分解的影響.pdf

1、背景：非酒精性脂肪性肝?。∟on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是代謝綜合癥中常見的一種疾病，現(xiàn)已成為歐美等發(fā)達國家和我國慢性肝病的重要病因，目前還沒有理想的預(yù)防和治療藥物。在NAFLD的發(fā)病機制中，由胰島素抵抗及其它因素引起的肝臟內(nèi)脂質(zhì)合成增加及沉積在疾病的發(fā)生發(fā)展中占據(jù)重要地位。硫化氫（Hydrogen sulfide），化學(xué)分子式為H2S，是一種能在人類和哺乳動物細胞內(nèi)合成的氣體分子遞質(zhì)，

2、可調(diào)控多種生理及病理生理過程。有研究顯示，內(nèi)源性H2S或外源性H2S供體的補充，可在生理或病理生理條件下影響肝臟正常的脂質(zhì)代謝。然而，H2S改變及控制肝臟脂質(zhì)代謝的機制尚不清楚。有文獻報道在大鼠脂肪細胞中，抑制胱硫醚γ裂解酶（Cystathionine-gamma-lyase，CSE）/H2S系統(tǒng)可通過PKA-脂肪包被蛋白/激素敏感性脂肪酶（Hormone sensitive lipase，HSL）途徑增強脂肪分解作用，增加血脂水平，從

3、而使肝細胞內(nèi)脂質(zhì)負荷增加，患NAFLD風(fēng)險增加。而給予H2S供體則會降低脂肪細胞內(nèi)的脂肪分解作用，這樣就有可能降低NAFLD風(fēng)險。由此課題組推測，外源性H2S可能會影響到肝細胞內(nèi)脂肪的合成及分解代謝。肝細胞內(nèi)脂肪過度蓄積可以抑制細胞自噬，H2S作為一種氣體分子遞質(zhì)，可激活細胞自噬，但是否能通過改變肝細胞的自噬水平來調(diào)節(jié)肝細胞的脂肪代謝目前還不清楚。
　　目的：探究H2S對肝細胞脂肪合成和分解代謝的影響以及細胞自噬對肝細胞脂肪變性的

4、影響，為進一步了解H2S在NAFLD的作用及開發(fā)H2S供體治療藥物提供理論依據(jù)。
　　方法：兩步原位灌流法分離培養(yǎng)C57BL/6小鼠原代肝細胞，體外用油酸（Oleic acid，OA）誘導(dǎo)肝細胞脂肪變性模型。研究 H2S對肝細胞脂質(zhì)合成影響時細胞分四組：對照組，給予等體積的培養(yǎng)液和10％的BSA，用于替換模型組所用的含1.2mmol/L的油酸（溶于10%的BSA）的培養(yǎng)液；模型組，用含1.2mmol/L油酸（溶于10%的BSA）的

5、培養(yǎng)液孵育原代肝細胞48h；H2S組和PAG組是指用含1.2mmol/L油酸（溶于10%的BSA）的培養(yǎng)液孵育原代肝細胞的同時分別給予1mM GYY4137和200μMPAG處理48h。油紅染色觀察細胞內(nèi)脂滴變化情況，比色法檢測細胞內(nèi)甘油三酯（TG）含量，觀察脂肪分解的實驗也分四組：對照組，給予等體積的培養(yǎng)液和10%的BSA，用于替換模型組所用的含1.2mmol/L油酸（溶于10%的BSA）的培養(yǎng)液；模型組，用含1.2mmol/L油酸（

6、溶于10%的BSA）的培養(yǎng)液孵育原代肝細胞48h；H2S組和PAG組是用含1.2mmol/L油酸（溶于10%的BSA）的培養(yǎng)液孵育原代肝細胞48h，然后換無血清無酚紅的RPMI1640培養(yǎng)液同時分別給予1mM GYY4137和200μM PAG處理6h。實驗結(jié)束時，收集各組細胞培養(yǎng)液檢測其中甘油含量，取細胞爬片做LC3免疫熒光，拍攝相差圖片；同時離心收集細胞制作電鏡標(biāo)本；用Western blotting方法檢測細胞中LC3A/B、HS

7、L和p-HSL的蛋白表達量。
　　結(jié)果：⑴用含油酸濃度為1.2mmol/L的培養(yǎng)液誘導(dǎo)肝細胞48h，油紅染色顯示細胞體積增大，輪廓模糊，胞質(zhì)中有大量脂滴形成，小鼠原代肝細胞脂肪變性模型建立成功。⑵在觀察脂肪合成的實驗中，與對照組相比，模型組肝細胞中甘油三酯含量明顯增高（P<0.05）；而與模型組相比，H2S組和PAG組肝細胞中TG含量無明顯變化。⑶在觀察脂肪分解的實驗中，與對照組相比，模型組甘油釋放量顯著增加（P<0.05），H2

8、S組與模型組相比甘油釋放量顯著減少（P<0.05）.Western blotting結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組 HSL的磷酸化水平明顯升高（P<0.05）；H2S組與模型組相比，HSL的磷酸化水平顯著降低（P<0.05）。⑷LC3免疫熒光、Western blotting結(jié)果顯示，H2S促進肝脂肪變性細胞LC3熒光顆粒和蛋白表達增加，相差顯微鏡下顯示細胞內(nèi)空泡增多，電鏡顯示自噬溶酶體數(shù)量增加。這些結(jié)果表明，H2S能夠促進原代肝脂肪變