阿膠真?zhèn)渭捌涑Ｒ娢廴揪腄NA分子鑒別.pdf

1、阿膠(Colla CoriiAsini)，又名驢皮膠，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，與人參、鹿茸并稱“中藥三寶”。阿膠主要的藥理作用是補(bǔ)血養(yǎng)血，對(duì)血?dú)獠蛔愕娜擞绕涫求w虛婦女特別適用。阿膠的原料只能是驢皮，但隨著市場(chǎng)對(duì)阿膠的需求量增大和毛驢存欄量不斷下降，阿膠的偽品在市場(chǎng)上逐漸泛濫，用于代替驢皮的其他動(dòng)物皮種類也越來(lái)越多，其中豬皮、牛羊皮的下腳料為數(shù)不少。這些偽品阿膠性味與真阿膠完全不同，一旦流入市場(chǎng)被患者服用，后果不堪設(shè)想。此外，阿膠中含有蛋白

2、質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)極為豐富的物質(zhì)，是微生物天然的培養(yǎng)基，在貯存環(huán)境不當(dāng)?shù)那闆r下容易受到微生物污染，影響質(zhì)量，一些污染微生物所分泌的生物毒素也是患者服用阿膠后致病的主要原因。因此，研究阿膠真?zhèn)魏退A存過(guò)程中的可能污染菌的檢測(cè)方法對(duì)維護(hù)患者用藥安全和市場(chǎng)穩(wěn)定具有重要的意義。
　　本論文包含兩個(gè)主要方面的研究：
　　一是通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物和探針，探索多重PCR和熒光PCR方法，建立一套鑒定阿膠真?zhèn)蔚姆肿訉W(xué)方法。本論文系統(tǒng)考察了傳統(tǒng)DNA提取

3、方法，并通過(guò)使用SDS法與CTAB法，優(yōu)化了阿膠的DNA提取方法。針對(duì)阿膠產(chǎn)品的自身特性，通過(guò)改變蛋白酶K的作用時(shí)間和改進(jìn)蛋白洗脫步驟對(duì)SDS法進(jìn)行優(yōu)化。與原有方法相比，新方法的提取量平均提高了0.022mg/ml，純度提高了48.3％。其次，使用兩種PCR技術(shù)對(duì)阿膠驢源性成分進(jìn)行鑒定。對(duì)市售阿膠進(jìn)行DNA提取后，通過(guò)查閱文獻(xiàn)和使用Primer Express5.0自行設(shè)計(jì)豬、牛、羊、兔、驢的引物，進(jìn)行多重 PCR反應(yīng)，使用凝膠電泳檢測(cè)

4、反應(yīng)結(jié)果，或者進(jìn)行Real-Time PCR反應(yīng)，通過(guò)熒光信號(hào)進(jìn)行測(cè)定。并通過(guò)人為添加非驢源性成分來(lái)保證實(shí)驗(yàn)的可靠性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，多重PCR技術(shù)和Real-Time PCR技術(shù)均能成功地將阿膠動(dòng)物源性成分檢出，人為添加非驢源性成分的對(duì)比實(shí)驗(yàn)也表明添加項(xiàng)均有檢出。該方法省時(shí)易行，可快速檢測(cè)阿膠真?zhèn)危异`敏度較高。
　　二是根據(jù)一些常見致病微生物的通用基因片段，設(shè)計(jì)其引物，使用分子學(xué)方法檢測(cè)阿膠是否被污染。根據(jù)文獻(xiàn)記載和市購(gòu)阿膠平板

5、涂布培養(yǎng)，本研究選取了雪白絲衣霉菌、沙門菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌這四種常見寄生于阿膠中的有害污染菌為檢測(cè)對(duì)象。根據(jù)雪白絲衣霉菌ITS2基因、沙門氏菌invA基因、鏈球菌Cps基因和金黃色葡萄球菌nuc基因，通過(guò)參閱文獻(xiàn)和自行設(shè)計(jì)，確定了4對(duì)特異性引物進(jìn)行多重PCR并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，4對(duì)引物能特異性地?cái)U(kuò)增出375bp、284bp、495bp、329bp的目的條帶，最佳退火溫度為55℃。此方法具有良好的特異性，靈敏度達(dá)到1.