HA-β-TCP-CS-PRF溫敏水凝膠修復(fù)兔顱骨缺損的實驗研究.pdf

1、目的：將富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）與一種溫敏型組織工程支架材料—羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA)/β-磷酸三鈣（tertiary calcium phosph-ate，β-TCP)/殼聚糖（chitosan，CS）復(fù)合，構(gòu)建HTCP凝膠，并通過細胞學(xué)和動物實驗驗證其成骨效果。
　　方法：⑴HTCP水凝膠的制備：將10mlCS溫敏凝膠、1mlPRF懸液與直徑為0.25mm的H

2、A和β-TCP（比例為3:7）混和，37℃孵箱15min，混合液凝結(jié)為固態(tài)，成為HA/β-TCP/CS/PRF凝膠（HTCP）。使用PH指示計進行PH值測定。通過傾斜試管的方法觀察HTCP溫敏水凝膠成膠時間。⑵HTCP水凝膠對兔骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）的影響：取第3代BMSCs以105個/cm2細胞濃度接種于24孔培養(yǎng)板中，細胞貼壁后，實驗組為常規(guī)成骨誘導(dǎo)液中加入新制備的HT CP水凝膠，對照組為常規(guī)成骨誘導(dǎo)液。成骨誘導(dǎo)8-14天

3、時，觀察兩組細胞生長狀態(tài)，3周時對兩組行ALP染色，并做MTT比色法分析。⑶HTCP水凝膠修復(fù)兔顱骨缺損的實驗研究：在24只新西蘭大耳白兔顱頂骨上各制備4個直徑為6mm的骨缺損區(qū)。4個缺損區(qū)內(nèi)按植入材料不同分為HTCP水凝膠組，HTC水凝膠組和PRF組，另設(shè)空白對照組，觀察4、8、12周取材。對實驗標本行大體觀察，X線觀察， CBCT觀察，HE染色及BMP-2免疫組織化學(xué)染色。
　　結(jié)果：①獲得的HTCP溫敏水凝膠呈乳白色不透明液

4、態(tài)，HA和β-TCP粉末顆粒懸浮于溶液中。測得PH值為6.5-7左右，在37℃恒溫箱中靜置15分鐘后可凝膠化。②MTT比色法分析BMSCs在HTCP水凝膠中可以正常存活和生長，未見明顯細胞毒性。ALP染色提示HTCP水凝膠可能促進BMSCs向成骨細胞分化。③大體觀察顯示，各組骨缺損區(qū)新骨生成隨時間逐漸增多，第4、8周時，HTCP組的新骨形成量均優(yōu)于對照組，第12周時，HTCP組與HTC組未見明顯區(qū)別，但優(yōu)于PRF組和空白對照組骨缺損修復(fù)

5、。④影像學(xué)顯示，各組缺損區(qū)透光區(qū)面積隨時間延長而逐漸減小，術(shù)后4、8周，實驗組透光區(qū)小于對照組。12周時HTCP組、HTC組、PRF組缺損區(qū)幾乎無透光影，片狀骨融合在一起，密度同周圍骨質(zhì)。⑤HE染色結(jié)果，術(shù)后4-8周 HTCP組，骨小梁，成纖維細胞等較對照組多。HTC組和PRF組對于引導(dǎo)骨再生的能力差異不明顯，但較空白組對骨缺損的修復(fù)均有促進和引導(dǎo)作用。12周時，HTCP組、HTC組、PRF組均有成熟的新骨與宿主骨融合，優(yōu)于空白對照組。

6、⑥BMP-2免疫組化觀察：第4周，各組BMP-2抗體染色均為明顯陽性，胞漿黃染；第8周， HTCP組BMP-2染色強陽性，其余各組為陽性，胞漿均被染成棕黃色；在12周時，各組陽性表達均有所減弱，未見明顯差別。
　　結(jié)論：HTCP水凝膠具有良好的生物相容性并促進BMSCs成骨分化，在兔顱骨缺損修復(fù)的早期和中期可取得較好的成骨效果，優(yōu)于單獨使用HTC或PRF。HTCP水凝膠作為一種溫敏組織工程骨的支架材料可以促進骨缺損的愈合修復(fù)，具有