妊娠中晚期鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯暴露對胎鼠生長發(fā)育的影響及其機制的研究.pdf

1、鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP）是使用最普遍的一種增塑劑，廣泛用于食品包裝、化妝品、建筑材料、兒童玩具等領(lǐng)域，可增加塑料制品的延展性和柔韌度。研究表明 DEHP是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物（environmental endocrine disruptors，EEDs），具有類似雌激素的作用，進入機體后會干擾體內(nèi)正常內(nèi)分泌物質(zhì)的合成、釋放、轉(zhuǎn)運及代謝過程，從而破壞人體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。

2、大量流行病學(xué)資料和動物實驗證實，DEHP具有生殖毒性、胚胎發(fā)育毒性、神經(jīng)毒性、免疫毒性等，進入體內(nèi)會引發(fā)多器官的損傷。我國DEHP用量大、使用范圍廣，因由此帶來的環(huán)境和健康問題不容忽視。本實驗從孕中期起通過灌胃方式給予Wistar大鼠不同劑量DEHP溶液，建立了簡便、有效的妊娠中、晚期DEHP毒性評價系統(tǒng)，以觀察胎鼠生長發(fā)育的情況。將大鼠胎盤作為核心組織，對相關(guān)分子在基因和蛋白水平進行檢測，為闡明DEHP胚胎發(fā)育毒性的作用機制提供理論依

3、據(jù)。
　　目的
　　1、孕中晚期通過灌胃給予Wistar大鼠不同劑量的DEHP溶液，建立妊娠中晚期大鼠DEHP染毒模型。
　　2、探討孕中晚期不同劑量DEHP暴露對大鼠胎盤組織形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的影響。
　　3、探討孕中晚期不同劑量DEHP暴露對胎鼠生長發(fā)育的影響。
　　4、探討DEHP胚胎發(fā)育毒性的作用機制。
　　方法：
　　1、將60只雌性Wistar大鼠隨機分為4組：對照組（玉米油）、低劑量

4、組（100mg/kg）、中劑量組（500mg/kg）和高劑量組（1000mg/kg）。妊娠11日起孕鼠每日灌胃給予DEHP溶液，妊娠第19日處死母鼠，觀察大鼠孕期一般情況。
　　2、記錄各劑量組胎鼠數(shù)量，計數(shù)活胎數(shù)、死胎數(shù)和畸胎數(shù)，測量胎鼠體重、身長和尾長，計算胎鼠心、肝、腎臟器系數(shù)。
　　3、測量胎盤質(zhì)量，取胎盤組織分別做HE染色和電鏡制片，觀察不同組間胎盤形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　4、選用大鼠全基因組表達譜芯片

5、檢測高劑量組和對照組間基因的變化，將差異表達基因按功能和通路進行分類。
　　5、熒光定量PCR驗證部分差異基因WT1、PPARα、FX、HNF1a、SFRP2、SPP1和AREG mRNA水平的變化。
　　6、檢測過氧化物酶體增殖物激活受體PPARs的三個亞型和視黃醛 X受體αmRNA和蛋白水平的變化。
　　7、選取 PPARs下游通路中脂代謝相關(guān)分子 FATP4、FABPs、FAT/CD36、CPT1A、ACOX-1

6、、SCD-1、LPL、EL，檢測它們mRNA水平和蛋白水平的變化。
　　結(jié)果：
　　1、DEHP灌胃后各組孕鼠一般情況良好，無流產(chǎn)和早產(chǎn)，無動物死亡。中和高劑量組孕鼠體重增加緩慢。
　　2、光鏡結(jié)果顯示低劑量組胎盤結(jié)構(gòu)無明顯改變，中和高劑量組胎盤結(jié)構(gòu)的改變主要在迷路帶和海綿滋養(yǎng)層。表現(xiàn)為海綿滋養(yǎng)層變薄，細胞變性、壞死，迷路帶擴張淤血。高劑量組胎盤改變最顯著。
　　3、電鏡下各劑量組胎盤超微結(jié)構(gòu)的改變主要表現(xiàn)在微絨

7、毛、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器的變化。高劑量組胎盤滋養(yǎng)層細胞結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)明顯的凋亡小體。
　　4、中和高劑量組胎鼠畸形率和死亡率明顯升高。胎鼠體重減輕，身長和尾長變小，生長受限。胎鼠肝和腎的臟器系數(shù)減小。
　　5、高劑量組和對照組相比，基因芯片共檢出表達大于2倍以上差異基因951個，其中表達上調(diào)基因424個，表達下調(diào)基因527個。
　　6、對篩選出的差異表達基因進行GO功能分析，上調(diào)基因主要參與的生物學(xué)過程包括：組織發(fā)育

8、、創(chuàng)傷修復(fù)、甾體類激素代謝、應(yīng)激反應(yīng)等。下調(diào)基因主要參與類固醇代謝、有機物的轉(zhuǎn)運、脂代謝等。
　　7、應(yīng)用KEGG pathway數(shù)據(jù)庫分析，上調(diào)最顯著的pathway是刺激神經(jīng)的配體-受體和細胞因子-細胞因子受體。下調(diào)最顯著的pathway是補體和凝血級聯(lián)反應(yīng)、脂肪的消化和吸收。
　　8、熒光定量PCR驗證，WT1、PPARα和AREG mRNA的表達上調(diào)，F(xiàn)X、HNF1a、SFRP2、SPP1的表達下調(diào)。與芯片結(jié)果一致。

9、
　　9、RXEα、PPARα和PPARγ在基因水平和蛋白水平隨著染毒劑量的增加，表達增強。PPARβ的表達無變化。
　　10、FATP4、FABPs和FAT/CD36蛋白水平的表達在中和高劑量組明顯升高，高劑量組表達量最高。FATP4、FABPs、FAT/CD36、CPT1A、ACOX-1、SCD-1、LPL、ELmRNA的表達呈遞增趨勢，高劑量組升高顯著。
　　結(jié)論：
　　1、妊娠中晚期DEHP暴露可影響胎盤