葡萄籽原花青素對(duì)阿爾茨海默病的作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　采用APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠及Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化損傷模型，通過(guò)建立體內(nèi)外阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)模型，分別從整體及細(xì)胞水平上共同探討葡萄籽原花青素對(duì)AD的作用及其可能的機(jī)制。
　　方法:
　　以APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠為AD動(dòng)物模型，從行為學(xué)、基因及蛋白表達(dá)水平共同探討葡萄籽原花青素對(duì)小鼠的影響。APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為:APP/PS1雙轉(zhuǎn)基

2、因模型組，鹽酸多奈哌齊組，葡萄籽原花青素低、高劑量組，并以同品系同齡C57BL/6小鼠作為正常對(duì)照組。給藥各組分別灌胃給予鹽酸多奈哌齊和葡萄籽原花青素藥液，模型及對(duì)照組給予等量生理鹽水。給藥2個(gè)月后，用Morris水迷宮法檢測(cè)小鼠空間學(xué)習(xí)與記憶的能力;小鼠處死后剖取海馬組織，分別采用HE和剛果紅染色法檢測(cè)小鼠海馬組織病理形態(tài)學(xué)和CA1區(qū)β淀粉樣蛋白沉淀情況;分別采用Real timePCR和Western blot的方法測(cè)定小鼠海馬組織

3、PS-1 mRNA和APP、Tau蛋白的表達(dá)。
　　PC12細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定后，以Aβ25-35誘導(dǎo)建立氧化損傷細(xì)胞模型。24小時(shí)后葡萄籽原花青素以12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml的濃度分別干預(yù)，并與正常培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)照。24小時(shí)后用CCK-8法和乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒分別檢測(cè)細(xì)胞活力及LDH漏出情況，采用流式細(xì)胞術(shù)法測(cè)定細(xì)胞凋亡率及其線粒體跨膜電位。

4、
　　結(jié)果:
　　Morris水迷宮法結(jié)果表明，與模型組比較，葡萄籽原花青素能明顯增強(qiáng)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的能力，表現(xiàn)為明顯縮短逃避潛伏期和上臺(tái)前的路程，增加穿臺(tái)次數(shù)、中央活動(dòng)區(qū)域路程比和時(shí)間比。HE染色結(jié)果顯示，模型組小鼠的海馬神經(jīng)細(xì)胞排列松散、紊亂，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，部分細(xì)胞空泡變性，大部分細(xì)胞胞體縮小，核固縮深染。而高劑量的葡萄籽原花青素使小鼠海馬的神經(jīng)細(xì)胞排列整齊、緊密，各層細(xì)胞輪廓清晰，未見(jiàn)固縮壞死及空泡變性。剛果紅染色結(jié)

5、果顯示，模型組小鼠的大腦海馬區(qū)見(jiàn)多處橘紅色斑塊沉積，而葡萄籽原花青素給藥組CA1區(qū)橘紅色斑塊沉積數(shù)量和面積均明顯減少。與模型組比較，Real time PCR和Western blot結(jié)果表明葡萄籽原花青素高劑量能顯著降低小鼠海馬區(qū)PS-1 mRNA、APP和Tau蛋白的表達(dá)。
　　PC12細(xì)胞培養(yǎng)第3天呈集落狀生長(zhǎng)，集落立體感強(qiáng)，形成密集的細(xì)胞簇，呈多角形、不規(guī)則形或梭形，具有典型的神經(jīng)細(xì)胞特征。CCK-8法結(jié)果表明，與模型組比

6、較，葡萄籽原花青素各給藥組可使光密度值(Optical density，OD)提高，表明細(xì)胞活力均顯著上升。LDH試劑盒檢測(cè)法結(jié)果表明，與模型組比較，葡萄籽原花青素各給藥組可使OD值顯著降低，表明細(xì)胞LDH漏出率均顯著降低。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)法結(jié)果表明，與模型組比較，葡萄籽原花青素給藥組的細(xì)胞凋亡率顯著降低，存活率和線粒體跨膜電位均顯著升高。
　　結(jié)論:
　　在AD的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)中，與模型組比較，APP/PS1小鼠的逃避潛伏期和上

7、臺(tái)前的路程明顯縮短，穿臺(tái)次數(shù)、中央活動(dòng)區(qū)域路程比和時(shí)間比明顯增加。以上結(jié)果提示，本研究中APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型成功，且葡萄籽原花青素可以提高小鼠學(xué)習(xí)記憶能力、改善AD導(dǎo)致的學(xué)習(xí)及記憶能力下降的癥狀。
　　在機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)中，與模型組比較，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬細(xì)胞排列整齊、緊密并橘紅色斑塊沉積數(shù)量及面積減少，且PS-1 mRNA、APP和Tau蛋白的表達(dá)均下降;與對(duì)照組比較，氧化損傷細(xì)胞的活力與線粒體跨膜電位增加，

8、LDH漏出率與凋亡率下降。以上結(jié)果提示，葡萄籽原花青素可保護(hù)細(xì)胞發(fā)生氧化損傷，降低LDH的漏出，提升線粒體跨膜電位，從而降低細(xì)胞凋亡率，同時(shí)下調(diào)PS-1 mRNA、APP和Tau蛋白的表達(dá)，并維持小鼠海馬結(jié)構(gòu)完整、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞及減少β淀粉樣蛋白的沉淀。
　　本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明葡萄籽原花青素具有提高APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠空間學(xué)習(xí)與記憶的能力，其作用機(jī)制可能與提高海馬細(xì)胞活力與線粒體跨膜電位，降低LDH漏出率，從而降低細(xì)胞的凋亡率