hESCs來源視杯樣組織中C-kit+-SSEA-4-祖細胞的細胞生物學特性研究.pdf

1、視網(wǎng)膜變性類疾病常引起感光細胞、視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細胞等多種視網(wǎng)膜細胞變性、死亡。由于二者均不可再生，移植正常的視網(wǎng)膜組織或者細胞，被認為是目前治療此類疾病最有前景的方法。許多研究者嘗試將干細胞分化為視網(wǎng)膜細胞后進行移植，可避免成瘤性風險，但單一種類終末分化的細胞移植無法解決視網(wǎng)膜色素變性(RP)患者視網(wǎng)膜中多種細胞丟失的難題。
　　研究表明肺、腎等器官來源的c-kit+（干細胞因子受體）細胞可跨胚層分化，具有明顯的器官特異

2、性。Sasai等更是利用三維培養(yǎng)技術在體外成功誘導胚胎干細胞(ESCs)形成與體內(nèi)正常胚胎發(fā)育相似的視泡(OV)樣、視杯(OC)樣組織。推測hESC(hESC)來源的OV、OC樣組織中c-kit+細胞是具有向多種視網(wǎng)膜細胞分化能力的視杯特異性祖細胞，可能成為治療視網(wǎng)膜變性類疾病的新型種子細胞。考慮到種子細胞的不可控增殖、成瘤等安全因素，我們同時篩除其中階段特異性胚胎抗原-4(SSEA-4)陽性的未分化細胞。
　　本實驗首先采用三維

3、培養(yǎng)技術誘導hESC形成OV、OC樣組織，并對其c-kit、SSEA-4的時空表達特點進行研究，然后對OC樣組織中c-kit+/SSEA-4-細胞的細胞生物學特性進行研究，從而為視網(wǎng)膜變性類疾病的治療提供理論依據(jù)。
　　目的:
　　1.觀察不同時間點三維培養(yǎng)OV、OC樣組織中c-kit、SSEA-4的空間表達特點及發(fā)育學變化規(guī)律;
　　2.通過流式細胞儀分選三維培養(yǎng)OV、OC樣組織中的c-kit+/SSEA-4-細胞，

4、并對其自我更新、增殖能力及多向分化潛能進行鑒定。
　　方法:
　　1.采用三維培養(yǎng)技術誘導hESC H1細胞系形成OV、OC樣組織，并通過免疫熒光染色分析OV、OC樣組織中Pax6、Mitf Rax、Crx等相關標記物的表達情況;
　　2.通過免疫熒光染色及流式細胞儀共同檢測hESC三維培養(yǎng)和誘導第7、14、21、30、49、70、90d OV、OC樣組織中c-kit、SSEA-4的時空表達規(guī)律;
　　3.流式細

5、胞儀分選三維培養(yǎng)第30天OC樣組織中的c-kit+/SSEA-4-細胞，通過免疫熒光鑒定第二代P2(Passage2)、P4、P6細胞Pax6、Nestin、Sox2等干細胞標記物及增殖指標Ki67的陽性率，同時檢測其細胞周期;誘導P3c-kit+/SSEA-4-細胞的分化，通過免疫熒光鑒定c-kit+/SSEA-4-細胞分化為感光細胞、神經(jīng)節(jié)細胞及RPE細胞的潛能。
　　結果:
　　1.hESC三維培養(yǎng)第14天可見Rax+

6、 OV樣組織，第30天形成具有內(nèi)層Pax6+、外層Mitf+的雙層OC樣結構，第90天可見部分Crx+細胞。
　　2.c-kit主要表達于hESC來源OV及OC的神經(jīng)上皮樣結構中，SSEA-4早期均勻表達于整個組織，晚期則主要集中于周邊部。c-kit+細胞比例呈先升高后下降的趨勢，并在分化第14d達40％的峰值。SSEA-4+細胞比例從分化0d至70d呈持續(xù)下降)趨勢，直到90d一直維持于該低水平。
　　3.hESC三維培養(yǎng)

7、第30天，類OC樣組織中的c-kit+/SSEA-4-細胞P2時Pax6、Nestin、Sox2陽性率分別為47.00％、63.90％、7.27％，隨著細胞的傳代，各指標陽性率稍有下降;Ki67陽性率在P2、P4、P6代分別高達75.61％、65.78％、60.80％,細胞周期檢測結果顯示G0/G1期細胞比例P2時達92.5％，后隨傳代而逐漸下降;P3代細胞經(jīng)定向誘導分化后，免疫熒光染色結果顯示其可表達感光細胞標記物Recoverin、

8、神經(jīng)節(jié)細胞標記物Tuj1、及膠質(zhì)細胞標記物GFAP和GS。
　　結論:
　　1.hESC H1細胞系可分化為高表達Rax的類OV樣組織，以及具有RPE層和神經(jīng)視網(wǎng)膜(neuroretina，NR)層的類OC樣組織;
　　2.三維培養(yǎng)hESC來源類OV、OC樣組織中，c-kit在誘導分化過程中被激活，主要表達于NR層，c-kit+細胞比例呈先增高后下降趨勢;SSEA-4早期高表達于整個組織，之后逐漸減少并局限于周邊部并維