銅在飲水和飲食條件下對(duì)小鼠生理效應(yīng)的影響及其機(jī)理研究.pdf

1、銅是人體必需的營(yíng)養(yǎng)元素，過(guò)量的銅會(huì)對(duì)健康造成危害，銅的吸收及毒性與其存在形態(tài)密切相關(guān)。人體中銅的主要來(lái)源為飲食與飲水，然而不同攝入方式下銅對(duì)生物體生理學(xué)效應(yīng)的影響差異卻鮮有報(bào)道。本文以雄性ICR小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物模型，研究不同方式下攝入的銅對(duì)小鼠氧化應(yīng)激、血清銅等生理參數(shù)及其十二指腸Ctr1、ATP7A等基因轉(zhuǎn)錄水平的影響;通過(guò)體外模擬消化研究銅與食品組（成）分的相互作用，及銅在不同攝入方式下的生物可接受度、絡(luò)合態(tài)和離子態(tài)的變化;以Caco

2、-2和HepG2細(xì)胞為模型探討離子態(tài)與絡(luò)合態(tài)銅的轉(zhuǎn)運(yùn)通路。取得了以下主要試驗(yàn)結(jié)果:
　　(1)銅的不同攝入方式對(duì)小鼠生長(zhǎng)及生理參數(shù)的影響。將72只雄性ICR小鼠隨機(jī)分為6組，分別以飲食或飲水的方式攝入生理需要量(6ppm)或過(guò)量(15、30ppm)的硫酸銅。經(jīng)過(guò)三個(gè)月的飼喂，飲水組小鼠體重增長(zhǎng)速率顯著低于飲食組(p＜0.05)，肝臟谷胱甘肽含量隨銅濃度的升高呈梯度性下降（分別為飲食組的81％、68％及59％，p＜0.05），超氧化

3、物歧化酶活力也僅有飲食組的87～91％(p＜0.05)，血清非銅藍(lán)蛋白結(jié)合銅（自由銅）升高為同劑量飲食組的124％，129％及169％(p＜0.05)。不同攝入方式下，小鼠肝、脾、腎、腦的銅含量無(wú)顯著梯度性差異(p＞0.05)，但在生理需要量的銅(6ppm)飼喂下，飲水組小鼠腦部可溶性β樣淀粉蛋白1-42(Aβ1-42)的含量相比同劑量飲食組上升了30％(p＜0.05)。試驗(yàn)說(shuō)明，在等于或高于生理需要量時(shí)，飲水?dāng)z入的銅會(huì)抑制小鼠生長(zhǎng)，增

4、加其肝臟的氧化損傷、增加血清中自由銅和腦中可溶性Aβ1-42的含量，有可能增加其罹患阿爾茨海默病的風(fēng)險(xiǎn)。
　　采用熒光定量PCR考察小鼠十二指腸銅轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn)，在銅的不同攝入方式與攝入濃度下，小鼠Ctr1與DMT1的mRNA水平無(wú)明顯變化(p＞0.05)。ATP7A，MT mRNA水平在飲水組不同銅濃度下無(wú)明顯差異(p＞0.05)，在飲食組中隨著銅濃度的增加梯度性上升，30ppm時(shí)顯著高于6ppm(p＜0.05

5、)，顯著高于同劑量飲水組(p＜0.05)。飲食組小鼠肝臟MT蛋白含量在15ppm和30ppm濃度下也顯著高于同劑量飲水組(p＜0.05)。
　　(2)模擬消化環(huán)境及不同食品組（成）分添加下，膳食銅（硫酸銅）的溶解度及電勢(shì)變化。試驗(yàn)得到在空白消化液中，隨著pH值的升高氫氧化銅沉淀逐漸形成，銅離子電勢(shì)降低，pH7.5時(shí)銅的溶解度為1.4±0.4mg/L，顯著高于水中銅的溶解度(0.3±0.2mg/L，p＜0.05)。當(dāng)在體系中添加葡萄

6、糖、蔗糖、果糖時(shí)，銅離子電勢(shì)變化與空白/消化液中類似，銅的溶解度低于3％。當(dāng)在消化液中添加有機(jī)酸或氨基酸組分時(shí)，隨著環(huán)境pH值的升高，添加的成分逐漸與銅形成可溶性絡(luò)合物，銅溶解度達(dá)到95％以上，銅離子電勢(shì)明顯低于空白/消化液體系(p＜0.05);當(dāng)添加酪蛋白、消化酶等物質(zhì)時(shí)，銅會(huì)與其形成大小不同的絡(luò)合物，銅的溶解度與配體的大小呈負(fù)相關(guān)。試驗(yàn)說(shuō)明銅具有較強(qiáng)絡(luò)合能力，與食糜的反應(yīng)符合廣義路易斯酸堿理論，并受到酸效應(yīng)的影響;消化道中銅的溶解度

7、和銅離子的濃度取決于環(huán)境的pH值和食糜的組成。
　　(3)體外模擬消化條件下不同飲食銅源（硫酸銅、氨基酸銅和蛋白銅）的生物可接受度、大小分布和離子活度變化。飲水?dāng)z入時(shí)，三種類型銅鹽（硫酸銅、氨基酸銅和蛋白銅）在模擬腸道所形成的化合物分子量主要分布在100Da～1kDa，生物可接受度為硫酸銅81±2％、氨基酸銅79.5±0.3％、蛋白銅76±7％;空腹飲水時(shí)，2mg/L的無(wú)機(jī)銅在100Da～1kDa的分布比例達(dá)到90±3％，生物可接

8、受度為96±1％。當(dāng)通過(guò)飲食攝入時(shí)，食品中的大分子物質(zhì)及聚合物會(huì)與銅發(fā)生絡(luò)合，100Da～1kDa的分布減少，10kDa以上的分布比例增加，銅的生物可接受度顯著下降（硫酸銅48±5％、氨基酸銅63±5％、蛋白銅60±4％，p＜0.05）。飲水?dāng)z入時(shí)，銅的離子電勢(shì)也顯著高于飲食攝入(p＜0.05):空腹飲水?dāng)z入時(shí)三種銅的離子電勢(shì)均高于280mV，飲水?dāng)z入時(shí)電勢(shì)分別為178±3、167±3及163±2mV，而飲食攝入時(shí)，電勢(shì)僅為148±2、

9、149±2及136±2mV。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明消化時(shí)各類有機(jī)物質(zhì)會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性的與銅發(fā)生絡(luò)合，相比飲食攝入，飲水?dāng)z入的銅在腸道中形成的化合物平均分子量小，生物可接受度和銅離子濃度均更高。
　　(4)離子態(tài)和絡(luò)合態(tài)銅在Caco-2細(xì)胞及HepG2細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)通路研究。Caco-2細(xì)胞在2μmol/L和6μmol/L的銅中孵育5～30min，離子態(tài)銅孵育的細(xì)胞銅含量均顯著高于絡(luò)合態(tài)銅組(p＜0.05);當(dāng)加入二價(jià)離子通路抑制劑（鋅離子）時(shí)，離子態(tài)

10、銅組細(xì)胞銅含量降低為對(duì)照組的77％(p＜0.05)，而絡(luò)合態(tài)銅組無(wú)明顯變化;Ctr1通路抑制劑（銀離子及卡鉑）的加入對(duì)兩種銅孵育的Caco-2細(xì)胞均無(wú)顯著影響。在HepG2細(xì)胞中，低濃度和短時(shí)間的銅孵育（離子態(tài)和絡(luò)合態(tài)銅）對(duì)細(xì)胞內(nèi)銅含量無(wú)顯著影響;當(dāng)加入鋅離子時(shí)，細(xì)胞內(nèi)銅含量（離子態(tài)和絡(luò)合態(tài)銅組）相比對(duì)照組均無(wú)明顯變化;銀離子及卡鉑的加入顯著降低了細(xì)胞對(duì)離子態(tài)和絡(luò)合態(tài)銅的吸收(p＜0.05)。6μmol/L的銅（離子態(tài)和絡(luò)合態(tài)）孵育細(xì)胞

11、5min，細(xì)胞活性氧水平及線粒體膜電位均無(wú)明顯變化。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知:銅的存在形態(tài)（離子態(tài)和絡(luò)合態(tài)）會(huì)影響其在腸道模型細(xì)胞（Caco-2細(xì)胞）的吸收，相比絡(luò)合態(tài)，離子態(tài)的銅更容易被吸收;Caco-2細(xì)胞中存在一種易于轉(zhuǎn)運(yùn)離子態(tài)銅，能夠被鋅離子抑制的銅轉(zhuǎn)運(yùn)通路;腸道模型細(xì)胞和肝臟模型細(xì)胞（HepG2細(xì)胞）吸收銅的主要通路可能不同。
　　上述研究結(jié)果表明，銅通過(guò)飲水方式攝入時(shí)，相比飲食攝入具有更高的生物可接受度和離子活度，進(jìn)入腸道細(xì)胞