GAL3敲除對(duì)釀酒酵母生理及乙醇發(fā)酵性能的影響.pdf

1、GAL3基因在真核生物中廣泛存在。酵母同樣為真核生物，與人類的基因具有相關(guān)性，可以作為人類基因功能研究的參考，而且是單細(xì)胞，具有生活史短，容易培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)。人類的歷史同樣是一部釀酒釀造史。如今的社會(huì)早已與乙醇無(wú)法割舍。乙醇除了用于人們的日常飲食外，同時(shí)還用于醫(yī)藥、化工、食品等行業(yè)。釀酒酵母的基因功能以及發(fā)酵性能一直是研究的重點(diǎn)與熱點(diǎn)。
　　釀酒酵母GAL3基因（ORF編號(hào)為GAL3）編碼表達(dá)GAL3p，是釀酒酵母半乳糖代謝中一個(gè)感應(yīng)

2、和信號(hào)傳導(dǎo)的基因。在以半乳糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中，在ATP的協(xié)助下，GAL3蛋白能與酵母半乳糖代謝中的抑制因子GAL80結(jié)合，從而使轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4能夠轉(zhuǎn)錄使酵母半乳糖代謝能夠順利進(jìn)行。本文以MF1015為出發(fā)菌株，構(gòu)建兩種單倍體菌株并通過(guò)同源重組敲除兩種單倍體的GAL3基因，再將敲除的單倍體菌株進(jìn)行復(fù)倍，得到一株GAL3突變體菌株，研究其生理特征以及乙醇發(fā)酵特性。
　　本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了MF1015菌株的a型和α型單倍體，并合成G

3、AL3基因敲除組件，成功將GAL3基因敲除組件轉(zhuǎn)入兩種單倍體中。利用敲除組件中的G418抗性進(jìn)行篩選，得到敲除GAL3基因后的單倍體突變菌株，然后轉(zhuǎn)入pSH65表達(dá)質(zhì)粒，利用半乳糖誘導(dǎo)消除G418抗性基因，再傳代遺失得到丟失pSH65質(zhì)粒的突變菌株。將兩種單倍體突變體菌株接入到Y(jié)PD培養(yǎng)基讓其自然交配并復(fù)倍，從而得到突變體MF1015-⊿GAL3。測(cè)定野生型菌株和突變體菌株的基本生理狀態(tài)及乙醇發(fā)酵性能，與野生型菌株相比，突變體菌株生長(zhǎng)速

4、率變慢，細(xì)胞形態(tài)由近似圓形變成橢圓形，呼吸作用降低，耐乙酸能力有明顯升高，耐乙醇能力略有降低;同時(shí)，對(duì)葡萄糖、蔗糖、棉籽糖、乳糖、半乳糖等糖的利用能力也略有降低。在環(huán)境中同時(shí)存在葡萄糖和半乳糖時(shí)，野生型菌株優(yōu)先利用葡萄糖，葡萄糖耗盡后，野生型菌株對(duì)半乳糖利用會(huì)延遲6小時(shí)左右，這種現(xiàn)象稱為葡萄糖阻遏。而敲除GAL3基因的突變體菌株這種延遲達(dá)2～5天，并且其耐半乳糖的耐受性也降低。在糖蜜補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，野生型和突變體發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇最大濃度分