電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）及高效液相色譜與電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-ICP-MS）用于富硒生物樣品中硒的化學(xué)形態(tài)組成及分布規(guī)律研究.pdf

1、硒作為一種重要的微量元素，具有提高GPx活性、SOD酶活性、增強抗氧化及提高免疫力等重要生理功能。機體硒水平下降將直接影響到骨骼、心肌、肝臟等重要臟器的生理功能。目前包括我國在內(nèi)的世界許多地區(qū)都處于缺硒狀態(tài)，開發(fā)富硒產(chǎn)品具有廣闊的開發(fā)前景和應(yīng)用價值。 由于硒化合物的使用劑量很窄，其毒性及有益性取決于其濃度與存在的化學(xué)形態(tài)，無機硒具有脂質(zhì)抗氧化，有機硒的營養(yǎng)水平較高。而硒的化學(xué)形態(tài)很不穩(wěn)定，某些復(fù)雜的樣品前處理易導(dǎo)致硒的損失及形態(tài)

2、轉(zhuǎn)變。到目前為止，硒的形態(tài)分析在國際上還沒有取得重大進(jìn)展。建立簡便有效的硒元素總量分析方法及化學(xué)形態(tài)定量分析方法，對于有機硒相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)及應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。 本文通過建立脅迫海帶富硒培養(yǎng)，實現(xiàn)了硒由無機形態(tài)向有機形態(tài)的轉(zhuǎn)化。首次采用近年發(fā)展起來的ICP-MS元素分析技術(shù)，研究了海帶對硒的富集能力及規(guī)律，ICP-MS技術(shù)的高靈敏度、低檢出限、寬線性范圍、可多元素同時分析等特點，滿足了對生物體微量元素總量的準(zhǔn)確定量分析。并且

3、，本文通過RP-HPLC高效分離與ICP-MS檢測器的聯(lián)用技術(shù)，建立了有效的RP-HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)，并用于富硒海帶的硒化學(xué)形態(tài)的定量分析；比較了四種提取介質(zhì)輔助超聲提取的樣品前處理方法，并進(jìn)行了方法學(xué)驗證；研究了微量元素硒經(jīng)海帶富集硒多種化學(xué)形態(tài)的組成及轉(zhuǎn)化分布規(guī)律，為富硒海帶的開發(fā)與應(yīng)用提供了理論依據(jù)。 將所建立富硒海帶的硒化學(xué)形態(tài)的HPLC-ICP-MS定量分析方法，進(jìn)一步應(yīng)用于富硒蒜苗硒形態(tài)的定量分析，并對該

4、方法進(jìn)一步方法學(xué)驗證，為生物硒形態(tài)的定量分析與產(chǎn)品開發(fā)奠定基礎(chǔ)。本論文結(jié)果主要有以下幾方面： (1)采用ICP-MS技術(shù)，初步對山東地區(qū)23種大型經(jīng)濟(jì)海藻的微量元素總量進(jìn)行了分析研究。實現(xiàn)了23種大型經(jīng)濟(jì)海藻多種微量元素多濃度級別的同時在線分析，樣品前處理簡單、方法快捷、結(jié)果準(zhǔn)確。實驗測得，23種海藻中人體必需微量元素(Na,Mg,Al,K,Ca,Zn,Fe,Cu,As)含量豐富，其中，褐藻門的鉀、鈣含量較高，綠藻門的磷含量較高

5、，而紅藻門的錳、鋅含量較高。硒在某些紅藻類和褐藻類含量較高，總體來說，硒的含量為：紅藻類高于褐藻類，高于綠藻類。海帶對微量元素的富集能力較強，富含K,Ca,Na,Mg,Zn，Mn,As等微量元素，Se濃度為0.281μg/g。海帶作為大型食用經(jīng)濟(jì)藻類，目前在我國養(yǎng)殖規(guī)模很大，因此被選作本文富硒培養(yǎng)和研究對象。 根據(jù)上述測得各微量元素濃度，進(jìn)行主成分分析與聚類分析，對藻類進(jìn)行化學(xué)識別，大致反映了影響不同門類元素特征的主要因素以及各

6、個門類的微量元素含量特征。分析得出：萱藻和叉開網(wǎng)翼藻、海帶和海木耳分別聚為一類，均屬于褐藻門類，三叉仙菜、真江蘺、帶狀蜈蚣藻、條斑紫菜、珊瑚藻相似度較高為一類，屬于紅藻門，而綠藻門的兩種藻，孔石莼和羽藻的元素特征相似度較近。說明，同一門類的元素的組成和分布具有一定程度的相似特征，該研究為不同藻類的識別提供了新的科學(xué)依據(jù)。 (2)建立和比較了三種色譜分離系統(tǒng)的RP-HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)對硒形態(tài)混標(biāo)(亞硒酸鈉、硒甲基硒代半

7、胱氨酸、硒代蛋氨酸)的分離。三種色譜系統(tǒng)對硒形態(tài)均分離良好，出峰順序為亞硒酸鈉、硒甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸。色譜系統(tǒng)①各峰分離良好，出峰時間較短，其流動相為酸性，對色譜柱性能要求較高，需耐酸性色譜柱；色譜條件②各峰得到良好的分離，硒代蛋氨酸出峰時間相對較長；色譜系統(tǒng)⑨分離峰形尖銳，出峰時間合適，流動相20mmol/L ammoniun acetic-methanol(95:5)為緩沖鹽系統(tǒng)，也滿足LC-MS，TOF-MS等儀器進(jìn)一步

8、結(jié)構(gòu)分析的系統(tǒng)要求，因此該系統(tǒng)被選作為下一步硒形態(tài)定量分析的色譜條件。 (3)建立了HPI℃-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)定量分析富硒海帶硒形態(tài)方法。研究比較了四種提取介質(zhì)(0.1mol/LHCl，0.1mol/LNaOH，20mmool/L NH4COOH-CH3OH(5％)，ProteaseXⅣ)輔助超聲提取的樣品前處理方法對硒形態(tài)進(jìn)行定量分析，并進(jìn)行方法學(xué)驗證，同時對富硒海帶的硒形態(tài)組成及分布規(guī)律進(jìn)行了研究。 首先，進(jìn)行實

9、驗室脅迫海帶富硒培養(yǎng)。首次采用ICP-MS元素分析技術(shù)進(jìn)行海帶硒總量測定，研究了海帶對硒的富集轉(zhuǎn)化規(guī)律。通過添加一定濃度的亞硒酸鹽(硒濃度10mg/l)及氮、磷營養(yǎng)鹽，控制水溫、光照、加氧等條件，采用掛繩法進(jìn)行實驗室脅迫海帶富硒培養(yǎng)，成功實現(xiàn)了元素硒在生物體內(nèi)的富集轉(zhuǎn)化。 采用密閉消解ICP-MS法研究富硒海帶硒濃度富集規(guī)律，在最初幾個小時內(nèi)，富硒速率較快，硒濃度迅速增加。海帶經(jīng)富硒培養(yǎng)8天，硒濃度可達(dá)到900μg/g，是富集前

10、(0.281μg/g)的3000多倍。 其次，比較了0.1mol/LHCl，0.1mol/LNaOH，20mmol/LNH414COOH-CH3OH(5％)，ProteaseXⅣ為提取溶劑、輔助超聲提取的樣品前處理方法，與以往報道的24小時振蕩或多種有機溶劑等提取過程相比，樣品處理采用超聲提取，大大縮短提取時間，步驟簡單，提取效果良好，減少了復(fù)雜處理過程可能造成的硒濃度損失及形態(tài)的轉(zhuǎn)變。經(jīng)方法學(xué)驗證，以0.1mol/L,HCl為

11、提取介質(zhì)，輔助超聲處理的RP-HPLC-ICPMS定量分析方法，線性(y=2325.9x，r=0.9999)、精密度(RSD=0.5％，n=7)良好，各硒形態(tài)濃度和占總硒的回收率可達(dá)82.00％，說明該方法用于硒化學(xué)形態(tài)定量分析簡便可行，準(zhǔn)確可靠。 以0.1mol/LMCl為提取介質(zhì)的HPLC-ICPMS定量分析，可明顯分離出富硒海帶四種硒形態(tài)，包括Na2SeO3，MeSeCys，SeMet以及一種未知硒組分，其中，Na2SeO

12、3分布比例較大，為72.26％，據(jù)推斷大部分Na2SeO3在較短富集時間內(nèi)還未能轉(zhuǎn)化為有機硒形態(tài)，通過延長海帶富硒時間，可提高有機硒的轉(zhuǎn)化率，同時減少實驗誤差，提高回收率，該有待于進(jìn)一步研究。 以0.1mol/LNaOH、緩沖鹽和蛋白酶為提取介質(zhì)，主要提取亞硒酸鈉和硒代蛋氨酸兩種形態(tài)，硒回收率較低。不同提取方式的HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)用于生物硒形態(tài)的定量分析有待于進(jìn)～步研究。 (4)將上章建立的HPLC-ICP-

13、MS技術(shù)進(jìn)一步用于富硒蒜苗硒化學(xué)形態(tài)的定量分析研究，并進(jìn)一步加以方法學(xué)驗證。 首先進(jìn)行了脅迫蒜苗富硒培養(yǎng)，蒜苗經(jīng)富硒培養(yǎng)30d，硒濃度達(dá)250μg/g，為富集前(0.121μg/g)的2066倍。采用上章建立的定量分析方法，以0.1mol/LHCl為提取介質(zhì)、輔助超聲的樣品處理方法，可明顯分離出富硒蒜苗六種硒形態(tài)組分：包括Na2SeO3，MeSeCys，SeMet以及三種未知硒組分，其中MeSeCys，SeMet的轉(zhuǎn)化率較高，分

14、別占總硒形態(tài)的分布比例為64.08％、13.29％，說明Na2SeO3經(jīng)蒜苗吸收可有效轉(zhuǎn)化為有機硒形態(tài)，而MeSeCys，據(jù)報導(dǎo)為一種抗癌活性前體。經(jīng)進(jìn)一步方法學(xué)驗證，線性及精密度良好，硒濃度回收率達(dá)102.5％，方法準(zhǔn)確可靠，可用于富硒蒜苗硒形態(tài)的定量分析。 以20mmol/L，ammonium acetic-methanol(50％)，ProteaseXⅣ為提取介質(zhì)，MeSeCys提取率相對也較高，分別占總硒形態(tài)的55.94

15、％和59.48％，硒回收率分別為82.87％及82.81％，也可滿足富硒蒜苗的硒形態(tài)定量分析。該研究進(jìn)一步為生物硒形態(tài)的HPLC-ICPMS定量分析奠定基礎(chǔ)，也為富硒蒜苗的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。 (5)將上述微波消解-ICP-MS技術(shù)對市售富硒產(chǎn)品的硒總量分析，給出科學(xué)準(zhǔn)確數(shù)據(jù)。市面上出現(xiàn)越來越多的富硒產(chǎn)品，其硒濃度沒有明確的數(shù)據(jù)標(biāo)示，而硒的濃度及形態(tài)對其生物功能有重要影響，本研究為富硒產(chǎn)品的合理應(yīng)用和推廣提供科學(xué)依據(jù)。

16、 經(jīng)測定，市售富硒雞蛋、富硒大蔥、富硒茶葉、富硒大米的硒濃度均較普通產(chǎn)品高出數(shù)倍。富硒雞蛋白的硒含量達(dá)到15.0μ/g，是普通雞蛋白 (4.07μg/g)的3.69倍，富硒蛋黃硒含量為6.31μg/g，為普通蛋黃(3.09μg/g)的2.04倍。 市售富硒大米、富硒茶葉、富硒大蔥、富硒元蔥的硒濃度均有不同程度增加，其硒濃度依次為0.113μg/g，0.459μg/g，0.214μg/g，12.2μg/g，分別為普通大米(0.05