光合細(xì)菌Rhodobacter sphaeroldes新型異源蛋白表達(dá)體系的構(gòu)建及其應(yīng)用研究.pdf

1、大腸桿菌和酵母是目前最常用的表達(dá)系統(tǒng),廣泛用于生產(chǎn)具有重要生物學(xué)功能的重組蛋白。但是,利用當(dāng)前商業(yè)化的表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白時(shí),都不能在提取前快速、實(shí)時(shí)地檢測(cè)其表達(dá)水平。
　　 類(lèi)球紅光合細(xì)菌Rhodobacter sphaeroides全基因組測(cè)序已經(jīng)完成,是研究細(xì)菌光合作用和膜蛋白形成的模式生物。在合適的生長(zhǎng)條件下,Rb.sphaeroides細(xì)胞質(zhì)膜(CM)會(huì)自動(dòng)內(nèi)嵌形成胞質(zhì)內(nèi)膜系統(tǒng)(ICM),同時(shí)捕光色素蛋白復(fù)合體2(LH

2、2)和LH1以及光化學(xué)反應(yīng)中心(RC)得到大量表達(dá),它們的含量可超過(guò)總膜蛋白的50％。其中,IM2由9對(duì)α-亞基和β-亞基組成,分別由puc1BAC操縱子的puc1A和puc1B編碼。研究發(fā)現(xiàn),該細(xì)菌中還有第二個(gè)puc操縱子puc2BA,也參與LH2的合成。LH2在～800 nm和～850 nm處有最大特征光譜吸收,LH2的表達(dá)量越高,特征光譜吸收峰值越大。因此,當(dāng)異源蛋白和LH2的α-亞基或β-亞基組成融合蛋白后,便可以在提取前通過(guò)分

3、析寄主細(xì)菌培養(yǎng)液在～800 nm和～850 nm處的光譜吸收而快速實(shí)時(shí)地檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)水平。
　　 本研究以Rb.sphaeroides DD13突變株(基因組缺失puc1BA和pufBALMX,缺少LH1、LH2和RC)為出發(fā)菌株,通過(guò)同源重組技術(shù),敲除第二個(gè)puc操縱子puc2BA獲得了突變體Rb.sphaeroides CQU68(基因組缺失puc1BA和pufBALMX,puc2BA);利用大腸桿菌乳糖操縱子基因la

4、cIq和lacO及Rb.sphaeroides puc1BAC操縱子的啟動(dòng)子pucP構(gòu)建了雜合啟動(dòng)子lacIq-pucP-lacO,并運(yùn)用該啟動(dòng)子及LH2β-亞基和α-亞基構(gòu)建了適合于Rb.sphaeroides表達(dá)異源融合蛋白的表達(dá)載體pRKlacIqpucPpuc1BHis101AC;通過(guò)His-tag標(biāo)簽建立了親和層析一步法快速純化LH2及LH2β-亞基融合蛋白的方法體系。利用CQU68突變體及上述表達(dá)載體表達(dá)了LH2β-亞基-G

5、FP和LH2β-亞基-HNP3融合蛋白。光譜吸收分析、SDS-PAGE和Western blotting結(jié)果表明,LH2β-亞基融合蛋白在～800 nm和～850 nm處的特征光譜吸收可以作為快速實(shí)時(shí)檢測(cè)融合蛋白表達(dá)水平的指標(biāo)。
　　 本文取得的主要結(jié)論如下:
　　 1、雜合啟動(dòng)子lacIq-pucP-lacO的構(gòu)建實(shí)現(xiàn)了LH2和IM2β-亞基融合蛋白表達(dá)的人為控制,它們的表達(dá)受氧氣濃度和IPTG的嚴(yán)格調(diào)控。只有在較低的

6、氧氣濃度(半好氧)并添加IPTG誘導(dǎo)的情況下,LH2及LH2β-亞基融合蛋白才能表達(dá);IPTG最佳使用濃度為1 mM。
　　 2、利用His-tag標(biāo)簽通過(guò)親和層析實(shí)現(xiàn)了LH2及LH2β-亞基融合蛋白的一步法快速純化。純化的LH2及LH2β-亞基融合蛋白仍結(jié)合著大量的細(xì)菌葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素,具有良好的電子傳遞活性。與傳統(tǒng)的蔗糖密度梯度離心法相比,該方法體系大大簡(jiǎn)化了LH2和LH2β-亞基融合蛋白的純化過(guò)程。
　　 3、利

7、用Rb.sphaeroides CQU68突變體成功表達(dá)了LH2β-亞基-GFP和LH2β-亞基-HNP3融合蛋白。融合蛋白表達(dá)后能夠伴隨著標(biāo)簽蛋白LH2β-亞基進(jìn)入ICM,在～800 nm和～850 nm處有LH2特異的光譜吸收。光譜吸收、SDS-PAGE和Westernblotting結(jié)果表明細(xì)菌培養(yǎng)液在～800 nm和～850 nm處的特征光譜吸收峰值越高,則LH2β-亞基融合蛋白的表達(dá)量越大。因此,在LH2β-亞基融合蛋白工程菌