基于螢火蟲(chóng)熒光素酶的凋亡檢測(cè)方法的建立及其在篩選結(jié)核分枝桿菌蛋白調(diào)控細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用.pdf

1、結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）簡(jiǎn)稱結(jié)核桿菌，是結(jié)核病的病原菌，目前世界上約1/3的人口感染結(jié)核分枝桿菌，其中5％-10％的感染者將發(fā)展成為活動(dòng)性結(jié)核病，全球每年新增結(jié)核病患者約880萬(wàn)，死亡約300萬(wàn)。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞發(fā)生的一種程序性死亡，在組織分化、器官發(fā)育、機(jī)體穩(wěn)態(tài)等生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。盡管細(xì)胞凋亡是一種正常的生理現(xiàn)象，但是異常的細(xì)胞凋亡常引起許多疾病。調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞凋亡是結(jié)核分枝桿菌致病性的

2、一部分，影響結(jié)核分枝桿菌的生存、繁殖、擴(kuò)散等過(guò)程。
　　快速準(zhǔn)確的檢測(cè)細(xì)胞凋亡是研究凋亡相關(guān)機(jī)制以及評(píng)價(jià)凋亡對(duì)疾病過(guò)程影響的基礎(chǔ)。Caspase-3的激活是細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)志，常被應(yīng)用于凋亡檢測(cè)方法的建立。為了方便快速的檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，本研究將caspase-3的識(shí)別序列與螢火蟲(chóng)熒光素酶融合表達(dá)構(gòu)建了一個(gè)新型的caspase-3報(bào)告質(zhì)粒，用于細(xì)胞凋亡的檢測(cè)，并篩選了部分結(jié)核分枝桿菌編碼的蛋白，具體研究?jī)?nèi)容如下

3、:
　　1.Caspase-3報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建及驗(yàn)證
　　本研究構(gòu)建了四種caspase-3報(bào)告質(zhì)粒，將四種報(bào)告質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，在細(xì)胞凋亡陽(yáng)性刺激物刺激下，四種報(bào)告質(zhì)粒熒光素酶的值明顯增加，同時(shí)熒光素酶被切割，說(shuō)明報(bào)告質(zhì)粒構(gòu)建成功。細(xì)胞凋亡發(fā)生時(shí)，233-DnaE-DEVDG激活超過(guò)25倍，其對(duì)照的值處于較低水平，而另外三種報(bào)告質(zhì)粒和相應(yīng)對(duì)照的值同時(shí)升高。這些結(jié)果說(shuō)明233-DnaE-DEVDG背景值低、敏感性高，更

4、適合應(yīng)用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　2.結(jié)核分枝桿菌ESAT-6家族蛋白的篩選
　　將結(jié)核分枝桿菌ESAT-6蛋白家族真核表達(dá)質(zhì)粒、233-DnaE-DEVDG和TK共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，通過(guò)雙熒光素酶試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌ESAT-6蛋白家族成員對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)esxA、esxT和esxL能激活233-DnaE-DEVDG并呈劑量依賴性，esxC不能激活233-DnaE-DEVDG。
　　3.篩選結(jié)果的驗(yàn)證
　

5、　為了驗(yàn)證篩選結(jié)果的可靠性，本研究通過(guò)經(jīng)典的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法驗(yàn)證。Caspase-3在細(xì)胞凋亡相關(guān)通路中處于中心位置，是評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡的核心指標(biāo)。本研究通過(guò)Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)esxA和esxT可以促進(jìn)caspase-3的活化，陰性對(duì)照esxC不能促進(jìn)caspase-3的活化;細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒染色后，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)esxA和esxT可以上調(diào)凋亡細(xì)胞比率。
　　4.核因子-κB(NF-κB)參與esxT誘導(dǎo)的細(xì)胞

6、凋亡
　　NF-κB通路與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，在一定情況下，NF-κB激活是細(xì)胞凋亡所必須的。為探究NF-κB通路是否參與esxT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，本研究通過(guò)雙熒光素酶試驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)esxT能激活NF-κ3啟動(dòng)子并呈劑量依賴性，用BAY11抑制NF-κB的激活會(huì)導(dǎo)致esxT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平部分下降，說(shuō)明NF-κB的激活參與了esxT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。NF-κB通路主要通過(guò)促進(jìn)其下游的促凋亡基因表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，為進(jìn)一步尋找esxT通過(guò)N