藏羚羊傳染性胸膜肺炎和華南虎鼻氣管炎的首次確診與流行病學研究.pdf

1、山羊傳染性胸膜肺炎是由山羊支原體山羊肺炎亞種(Mccp)感染山羊引起的一種高度接觸性呼吸道傳染病，以高熱、高發(fā)病率、高死亡率及胸膜炎、纖維素性肺炎為特征，對非洲、亞洲等國家的羊養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重危害，被世界動物衛(wèi)生組織列為法定報告?zhèn)魅静　Ｒ吧蝾惖牟∷篮土餍袌蟮朗趾币姟?br>　　貓鼻氣管炎又稱貓傳染性鼻氣管炎，是由貓皰疹病毒Ⅰ型(FHV-1)引起的一種傳染性較強的貓科動物上呼吸道疾病，在我國等多個國家廣泛流行，死亡病例多見于幼齡個體。華

2、南虎的致死性感染和虎源FHV-1的分離鑒定未見有相關報道。
　　2012-2013年，西藏那曲地區(qū)藏羚羊發(fā)生大批量死亡事件，我們通過電鏡觀察、組織病理學檢查、特異性PCR/RT-PCR、基因序列進化分析、病原分離鑒定等方法，首次確認了藏羚羊傳染性胸膜肺炎疫情;繼而通過流行病學調查發(fā)現(xiàn)本病最早可能發(fā)生于2006年，風險分析與評估表明該病呈現(xiàn)地方性流行且在家羊和野生小反芻獸間互相傳播的風險很高。此外，我們還確認了深圳野生動物園的華南虎

3、死亡病例系由貓病毒性鼻氣管炎感染所致。主要研究內容和結果如下:
　　一、藏羚羊疑似疫情的現(xiàn)場調查與初步診斷
　　1.流行病學調查發(fā)現(xiàn)，西藏境內曾發(fā)生過與山羊傳染性胸膜肺炎癥狀十分相似的家羊“疑難病”和藏羚羊“肺熱病”;明確了西藏那曲地區(qū)申扎、雙湖、尼瑪和班戈4縣內藏羚羊種群數(shù)量的統(tǒng)計值和估計值。
　　2.疑似疫情發(fā)生地死亡藏羚羊的臨床癥狀和剖檢，可見鼻腔和口腔流出白色泡沫狀液體，明顯局限于胸腔內的肺臟“肝樣變”及肺表面

4、、胸膜上有白色附著物和灰綠色纖維素膜;在申扎、雙湖、尼瑪3縣采集到13只死亡藏羚羊的肺組織等樣品。
　　3.5只藏羚羊肺臟的組織病理學檢查，呈現(xiàn)單核細胞和嗜中性白細胞大量滲出、肺泡內大量漿液和纖維素滲出等不同病程的纖維素性肺炎病變，及以肺間質增寬明顯、組織壞死、漿液和炎性細胞浸潤為主的間質性肺炎病變。處理后的SH3肺臟樣品用透射電子顯微鏡觀察，可見到大量直徑介于100nm～300nm，呈螺旋狀等多形性的支原體樣顆粒。
　　4

5、.以絲狀支原體簇16S rRNA基因引物對13份藏羚羊肺臟樣品進行特異性PCR檢測，結果有11份樣品擴增獲得了785bp目的片段。11份陽性克隆質粒的測序和序列比對結果顯示，11條寡核苷酸片段間的序列同源性約為99.8％，其與牛群7支原體等絲狀支原體簇成員的同源性在99.2％以上，與Mccp的同源性最高。Mccp arcD基因的特異性PCR結果，11份樣品均擴增獲得了316bp目的片段。
　　根據(jù)上述調查和檢測結果，將西藏那曲地區(qū)

6、藏羚羊群發(fā)性死亡事件，初步診斷為Mccp引起的山羊傳染性胸膜肺炎疫情。
　　二、Mccp分離鑒定及對藏羚羊致病性確立
　　1.將13只藏羚羊的肺組織樣品處理后接種改良的Hayflick's肉湯，經(jīng)過2-3次連續(xù)傳代培養(yǎng)，11份樣品的培養(yǎng)物均能夠觀察到支原體生長。
　　2.11份樣品的陽性培養(yǎng)物在電子顯微鏡觀察下，均可見短桿狀支原體樣顆粒;特異性PCR結果顯示，11份培養(yǎng)物中絲狀支原體簇5個成員(MmmSC、MmmLC/

7、Mmc、Mcc和M1)的PCR均為陰性，Mccp arcD基因和H2基因PCR為陽性，擴增分別得到316bp、562bp目的片段;將其中SH3樣品對應的H2基因PCR產(chǎn)物進行回收、克隆、測序、比對和進化分析，顯示所獲寡核苷酸序列與其它Mccp分離株間的序列同源性較高(99.3％～99.7％)，與非洲和亞洲的Mccp分離株屬于同一進化分支。
　　3.對可能感染藏羚羊的16種病原體進行特異性PCR/RT-PCR檢測，13份藏羚羊肺樣品

8、中BTV、MVV、CAEV、FMDV、RPV、BPIV、Cb、Cw、Ps、Mb、Ml、MmmLC/Mmc、Mcc、MmmSC、Movi的擴增結果全部為陰性。
　　上述方法和結果表明，成功從藏羚羊樣品中分離鑒定了Mccp，排除了16種病原體感染藏羚羊的可能，進而確認了Mccp對藏羚羊的感染、高度致死性和那曲地區(qū)藏羚羊CCPP疫情。
　　三、藏羚羊CCPP流行特點和風險分析及防控探討
　　1.利用特異性PCR方法，分別對2

9、013年3月西藏阿里地區(qū)送檢的8份死亡家山羊肺組織樣品和2013年9月西藏那曲地區(qū)申扎縣、尼瑪縣送檢的5份死亡藏羚羊肺組織樣品進行檢測，均擴增得到Mccp arcD基因的316bp目的片段;各取其中1份陽性克隆質粒進行測序和分析，結果顯示家山羊和藏羚羊Mccp arcD基因序列間及與其它Mccp分離株間具有有較高的序列同源性(99.4％～99.8％)。
　　2.疫情統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，自2012年9月9日起，西藏那曲地區(qū)CCPP疫情已間斷性

10、發(fā)生約505天，共監(jiān)測到藏羚羊等2亞科、4屬（種）、2869只野生小反芻獸死亡，涉及4個縣、10個鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）的26處疫點。
　　3.流行特點分析表明，藏羚羊的種群死亡率最高達18.92％，其死亡數(shù)（2648只）占比為91.54％;疫點相對集中在色林錯湖周邊并呈環(huán)狀分布，該區(qū)域內易感物種死亡數(shù)量占總數(shù)的84.04％; CCPP疫情可劃分為2個差異明顯的流行周期，流行動力逐漸衰減;死亡動物的雌雄比平均為68∶32，CCPP在4物種的可能

11、潛伏期為7天～16天。
　　4.流行風險分析表明，CCPP可能在2006年前即已流行于西藏阿里地區(qū)的家山羊和那曲地區(qū)的藏羚羊中;盤羊作為Mccp儲存宿主的可能性最高;家羊引種調運、過載放牧、散放游牧以及藏羚羊遷徙是CCPP流行的主要風險因素;這些因素與天氣劇烈變化的疊加可能導致了本次藏羚羊CCPP疫情的暴發(fā)和區(qū)域性流行;CCPP呈現(xiàn)地方性流行并在家羊和野生小反芻獸間互相傳播的風險很高，向那曲周邊地區(qū)、省份擴散的風險較高。
　

12、　5.防控措施方面，建議開展家羊用CCPP火活疫苗及野生動物CCPP流行病學調查、風險評估、經(jīng)水口服疫苗等科研攻關，并將山羊傳染性胸膜肺炎納為農(nóng)業(yè)、林業(yè)部門的法定報告?zhèn)魅静」芾恚哟蠹已虻漠a(chǎn)地檢疫、野生小反芻獸的種群監(jiān)測等。
　　四、華南虎中FHV-1的分離鑒定及流行風險的調查評估
　　1.采用特異性PCR/RT-PCR方法，對深圳野生動物園的死亡華南虎樣品進行FHV-
　　1、CDV/FeDV和FCV檢測，結果顯示僅

13、FHV-1的292bp目的片段得到特異性擴增;基于FHV-1 TK基因(253bp)和gB基因(566bp)寡核苷酸片段的序列比對和系統(tǒng)進化分析表明，其與FHV-1參考毒株高度同源，親緣關系密切。
　　2.接種樣品后的F81單層細胞出現(xiàn)明顯的CPE;培養(yǎng)物透射電子顯微鏡下可觀察到典型皰疹病毒特征的顆粒;培養(yǎng)物PCR/RT-PCR核酸檢測結果僅FHV-1呈陽性。
　　3.細胞培養(yǎng)物接種實驗貓后，發(fā)病貓表現(xiàn)為鼻、眼瞼等部位的分泌

14、物增多，上呼吸道癥狀和持續(xù)性體溫升高;鼻洗液和咽拭子等樣品的PCR檢測結果呈陽性，顯示攻毒貓從第6天開始排毒并持續(xù)至第20天。
　　4.通過特異性PCR方法，對深圳野生動物園開展FVR流行調查和風險評估，結果顯示所采集的流浪貓等動物的鼻喉拭子樣品PCR結果全部為陰性，表明華南虎的死亡情況屬于“個案”;風險分析認為，貓病毒性鼻氣管炎(FVR)形成區(qū)域性流行的風險較低，但散發(fā)病例出現(xiàn)的風險較高。
　　5.在華南虎FVR的防控中，