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1、犬瘟熱防控研究成就與進(jìn)展 犬瘟熱防控研究成就與進(jìn)展2011 級(jí)生物科學(xué) 20114083049 張 岳摘 要:犬瘟熱(Canine distemper ,CD) 是由犬瘟熱病毒(Canine distemper virus ,CDV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病,流行范圍廣,發(fā)病率、致死率高,臨床癥狀多樣。CDV感染宿主廣泛,所有日齡的犬都有可能感染。CDV屬于副粘病毒科麻疹病毒屬,有囊膜包裹的單股負(fù)鏈線(xiàn)性RNA病毒。CDV基
2、因組編碼6種蛋白,核衣殼(N)蛋白、磷(P)蛋白、基質(zhì)膜(M)蛋白、融合(F)蛋白、血凝素(H)蛋白和大(L)蛋白。N、P和L蛋白與病毒復(fù)制有關(guān);M蛋白與病毒的裝配和出芽有關(guān);F、H蛋白在病毒的侵染過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。近年來(lái),隨著我國(guó)寵物業(yè)、毛皮經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展,CD在我國(guó)的發(fā)病率有升高的趨勢(shì)。論文對(duì)CDV分子生物學(xué)研究進(jìn)展進(jìn)行歸納總結(jié)。 關(guān)鍵詞: 關(guān)鍵詞:犬瘟熱病毒,致病機(jī)理,分子生物學(xué),致病機(jī)理,診斷檢測(cè),防御治療犬瘟熱(Can
3、ine distemper ,CD)是由犬瘟熱病毒(Canine distemper virus ,CDV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病,流行范圍廣,發(fā)病率及致死率高。臨床癥狀多表現(xiàn)為“雙相熱”,眼鼻有黏液樣分泌物,伴有腹瀉,嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)血便,四趾肉墊增厚、角質(zhì)化明顯,神經(jīng)癥狀多表現(xiàn)為抽搐。CDV感染宿主廣泛,主要為食肉目動(dòng)物,如犬科、鼬科、浣熊科、貓科和靈貓科等,但主要宿主為犬科動(dòng)物,所有日齡的犬都有可能感染[1]。本文將近期CDV
4、分子生物學(xué)研究進(jìn)行歸納總結(jié),為深入研究提供參考。 犬瘟熱病毒的分子生物學(xué) 犬瘟熱病毒的分子生物學(xué)CDV屬于副黏病毒科麻疹病毒屬,為有囊膜包裹的單股負(fù)鏈線(xiàn)性RNA病毒。呈圓形或橢圓形,有時(shí)呈長(zhǎng)絲狀。直徑約為150nm,核衣殼呈螺旋對(duì)稱(chēng)。CDV只有1種血清型,根據(jù)血凝素(H)基因的多樣性和病毒的毒力,分6種基因型(Asia1、Asia2、Europe、USA、Arctic和Vaccine)。由于具有囊膜,CDV對(duì)有機(jī)溶劑敏感,對(duì)酸堿抵抗力弱
5、,所以臨床上常用消毒方法即可殺滅;CDV對(duì)熱和干燥敏感,故該病多流行于冬春寒冷季節(jié)。CDV侵染不同類(lèi)型的細(xì)胞,如上皮、間質(zhì)、神經(jīng)內(nèi)分泌和造血干細(xì)胞,在不同組織和器官內(nèi)造成持續(xù)感染,例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和淋巴組織[2]。感染犬通常表現(xiàn)為呼吸道、胃腸道以及其他組織和器官的多種臨床癥狀,其中急性感染導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘性腦脊髓炎(demyelinating leukoencephalomyelitis,DL),并引起嚴(yán)重的全身免疫抑制
6、和淋巴組織損耗[2-4]?;蚪M位于病毒粒子內(nèi)部,被核衣殼蛋白包裹,基因組全長(zhǎng)約16kb,基因組呈線(xiàn)性排列。從3’端至5’端的基因順序依次為前導(dǎo)序列、N、P、M、F、H、L、前導(dǎo)(尾隨)序列。3’端前導(dǎo)序列由55個(gè)核苷酸組成,5’端前導(dǎo)(尾隨)序列由38個(gè)核苷酸組成。3’端前導(dǎo)序列和5’端前導(dǎo)(尾隨)序列,被認(rèn)為是啟動(dòng)、調(diào)節(jié)序列,指導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄復(fù)制過(guò)程,同時(shí)又是CDV基因的轉(zhuǎn)錄終止、重起始序列。兩序列之間包括6個(gè)非重疊基因區(qū),編碼六種基
7、因蛋白:核衣殼蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質(zhì)膜蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(H)、大蛋白(L)。N、P和L蛋白形成核糖核蛋白復(fù)合體(RNP)包裹病毒RNA,三種蛋白與病毒復(fù)制過(guò)程相關(guān);兩種表面糖蛋白F和H 蛋白黏附在囊膜表面,形成纖突在病毒感染侵入過(guò)程中發(fā)揮重要作用;M蛋白則嵌合到囊膜內(nèi),在糖蛋白與核衣殼連接中起橋連作用,同時(shí)與病毒的裝配和出芽有關(guān)。1、核衣殼 、核衣殼(N) (N)蛋白及其基因 蛋白及其基因核衣殼(N)蛋白
8、基因由1683個(gè)核苷酸組成,有一個(gè)開(kāi)放閱讀框起始于53位~55位的AUG起始密碼子,共編碼523個(gè)氨基酸,分子質(zhì)量為58ku。N蛋白基因由中間保守區(qū)和N末端、C末端的可變區(qū)組成[5]。N蛋白具有較高的保守性,能誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫。N蛋白的C末端1aa~80aa、337aa~358aa為抗原識(shí)別不可或缺的抗原表位,能誘導(dǎo)體液免疫產(chǎn)生抗體[6];N蛋白的9氨基酸寡肽(281aa~289aa,Tyr-Pro-Ala-Leu-His-Glu
9、-Phe)介導(dǎo)CTL反應(yīng),可能是CTL活性細(xì)胞作用靶細(xì)胞的抗原表位之一,對(duì)CDV引起的細(xì)胞免疫具有重要作用[7-8]。N蛋白和P、L蛋白與復(fù)制過(guò)程相關(guān),P和L蛋白具有RNA聚合酶活性,隨后N蛋白包裹病毒RNA,避免RNA降解[9-10],三者能夠構(gòu)成一個(gè)復(fù)制單位-核糖核蛋白復(fù)合體(RNP)。N蛋白上有特定的細(xì)胞核定位信號(hào)(NLS)和細(xì)胞核轉(zhuǎn)出信號(hào)(NES),NLS和NES為N蛋白核轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中所必需的[11]。Yoshida E等[6]
10、通過(guò)間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(IFA)測(cè)得,缺失了N末端的1aa~80aa的N蛋白只4、融合 、融合(F) (F)蛋白及其基因 蛋白及其基因融合(F)蛋白基因長(zhǎng)為2205個(gè)核苷酸,F(xiàn)蛋白分子質(zhì)量為62ku,由F1和F2由兩個(gè)亞單位蛋白組成,翻譯時(shí)起始于461~463位的AUG到757位核苷酸,編碼99個(gè)氨基酸為F2蛋白,分子質(zhì)量為23ku,從758至2071位核苷酸,編碼438個(gè)核苷酸為F1蛋白。F1蛋白嵌入囊膜,而F2蛋白位于囊膜外側(cè),F(xiàn)1蛋
11、白和F2蛋白通過(guò)二硫鍵連接。F蛋白經(jīng)蛋白酶裂解分為三個(gè)部分,縮氨酸信號(hào)肽、F2蛋白和F1蛋白[20]。裂解位點(diǎn)AQIHW在縮氨酸信號(hào)肽的C端,而RRQRR在F1蛋白的N端[21-23],這兩個(gè)裂解位點(diǎn)是高度保守的。縮氨酸信號(hào)區(qū)在前體蛋白F0被裂解成F1蛋白和F2蛋白的過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用[24]。將Asia 1型和Asia 2型CDV的縮氨酸信號(hào)區(qū)分別與Onderstepoort株進(jìn)行比對(duì),氨基酸差異性分別為30%~32%和34%~
12、35%,核苷酸序列差異性分別為15%~16%和18%~19%,說(shuō)明該信號(hào)肽序列的多樣性。F1蛋白具有融合功能,它包括N端的縮氨酸融合區(qū)(FP)、穿膜區(qū)(TM)和C端的cytoplasmic tai區(qū)(CT);F2蛋白具有附著功能。Asia型CDV的F蛋白上有7個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn),其中4個(gè)分別在F2蛋白區(qū)的141位~143、173位~175和179位~181位和F1蛋白區(qū)的517位~519位[25]。另外3個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)具有一致的氨基
13、酸序列(N-X-S/T),而且只在A(yíng)sia 1型CDV中被發(fā)現(xiàn)。其中2個(gè)在縮氨酸信號(hào)區(qū)的62位~64位和108位~110位,最后一個(gè)則在個(gè)別Asia 1型CDV F1蛋白區(qū)的605位~607位[26]。F蛋白是位于CDV囊膜上的I型糖蛋白,以非共價(jià)鍵連接的同源三聚體形式存在,介導(dǎo)囊膜和細(xì)胞膜融合,使病毒具有在宿主體內(nèi)擴(kuò)散的能力,是感染性病毒粒子進(jìn)入宿主細(xì)胞所必需的。Von Messling等[15]構(gòu)建了3種重組質(zhì)粒58utrMF-N
14、P、58△F106和58utrMF-NP△F106。研究表明只缺失F蛋白縮氨酸信號(hào)(Fsp)區(qū)不影響病毒感染的進(jìn)程和結(jié)果;將M-F UTR替換成N-P UTR能夠延長(zhǎng)病毒在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的感染進(jìn)程;縮短M-F UTR能夠提高F蛋白轉(zhuǎn)錄水平,進(jìn)而促進(jìn)F蛋白的翻譯和成熟病毒的產(chǎn)生。結(jié)果證明,麻疹病毒屬病毒M-F基因區(qū)通過(guò)控制F基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄過(guò)程來(lái)調(diào)節(jié)病毒的抗原性[27]。5、血凝素 、血凝素(H) (H)蛋白及其基因 蛋白及其基因血凝素(
15、H)蛋白基因長(zhǎng)為1946個(gè)核苷酸,有一個(gè)開(kāi)放閱讀框,起始于21位~23位ATG,終止于1833位~1835位的TAA,編碼604個(gè)氨基酸,分子質(zhì)量為76ku。在麻疹病毒屬所有的結(jié)構(gòu)蛋白基因中,H蛋白基因變異性最大。H蛋白是CDV囊膜表面主要的糖蛋白之一,為Ⅱ型糖蛋白,是構(gòu)成囊膜纖突的主成分,決定了CDV的宿主特異性,并協(xié)助F蛋白使病毒囊膜與宿主細(xì)胞發(fā)生膜融合侵入宿主細(xì)胞。CDV的H蛋白首先吸附于宿主細(xì)胞SLAM受體上,隨后H蛋白的構(gòu)象發(fā)
16、生改變,產(chǎn)生信號(hào)給F蛋白使病毒囊膜和宿主細(xì)胞發(fā)生膜融合,進(jìn)而入侵宿主細(xì)胞。而且膜融合的程度和效率也依賴(lài)于H蛋白[28-30]。H蛋白還決定CDV的生長(zhǎng)特性和趨向性[29]。也是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要蛋白之一,而且抗CDV H蛋白單克隆抗體(McAb)保護(hù)力強(qiáng)于抗F蛋白McAb[31]。CDV H蛋白有廣泛的糖基化位點(diǎn),但是野毒株與疫苗株H蛋白的潛在糖基化位點(diǎn)不同,野毒株為8個(gè)~9個(gè),而Onderstepoort株為4個(gè)[32-3
17、3]。形成大蝕斑的Onderstepoort(OL)株的H蛋白在60位氨基酸殘基處與野毒株5804P的H蛋白存在差別,可能是5804P株多了幾個(gè)潛在N-糖基化位點(diǎn),而且疫苗株H蛋白的分子量小于野毒株的H蛋白。由此可以推測(cè)減少的N-糖基化位點(diǎn)可能對(duì)病毒感染性減弱起到關(guān)鍵作用,如果增加N-糖基化位點(diǎn)可能最終導(dǎo)致疫苗免疫失?。?5,33-34]。OL疫苗株的H蛋白較5804P強(qiáng)毒株的H蛋白少了3個(gè)潛在連接N-糖基化位點(diǎn),導(dǎo)致了在309(N~S
18、)、393(T~A)和456(N~D)氨基酸序列的改變。Von Messling V等[29],研究證明了野毒株5804P的H蛋白上的7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的膜外N-糖基化位點(diǎn)和一個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)的N-糖基化位點(diǎn),其中5個(gè)可能被利用。將5804P H蛋白N-糖基化位點(diǎn)突變,保留與OL株相同的3個(gè)糖基化位點(diǎn),構(gòu)建p5804P-HOL-like重組質(zhì)粒,經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá),發(fā)現(xiàn)重組病毒致病性減弱,證明H蛋白的糖基化影響病毒的毒力;再使其H蛋白上的N-糖基化位點(diǎn)全部
19、缺失,構(gòu)建p5804P-H5ko和p5804P-H6ko重組質(zhì)粒,發(fā)現(xiàn)重組病毒不再引起發(fā)病,但是仍然具有引起免疫抑制的能力,這就證明了H蛋白N-糖基化位點(diǎn)的減少,能夠引起病毒感染性減弱而不影響免疫抑制反應(yīng)。所以H蛋白的N-糖基化位點(diǎn)對(duì)于病毒感染進(jìn)程是必不可少的,并且影響病毒的感染性。6、大 、大(L) (L)蛋白及其基因 蛋白及其基因大(L)蛋白基因長(zhǎng)為6573個(gè)核苷酸,有一個(gè)開(kāi)放閱讀框起始于23位的AUG,編碼2161個(gè)氨基酸,5’端
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