1.抗鼠免疫球蛋白gfc段單域重鏈抗體及堿性磷酸酶的表達(dá)和酶活分析2.大腸桿菌遺傳操作系統(tǒng)改造的研究

1、分類號(hào)： 密級(jí)： U D C ：學(xué)號(hào)：405611611103 南 昌 大 學(xué) 碩 士 研 究 生 學(xué) 位 論 文 1 抗鼠免疫球蛋白 抗鼠免疫球蛋白 G Fc 段單域重鏈抗體及堿性磷 段單域重鏈抗體及堿性磷酸酶的表達(dá)和酶活分析 酸酶的表達(dá)和酶活分析 2 大腸桿菌遺傳操作系統(tǒng)改造的研究 大腸桿菌遺傳操作系統(tǒng)改造的研究 1 Expression and Acti

2、vity Analysis of Single Domain Antibody Fragments for the Fc Region of Mouse IgG and Alkaline Phosphatase 2 Research on Transformation of E.coli Genetic System 王瑤 培養(yǎng)單位（院、系） ：生命科學(xué)與食品工程學(xué)院 指導(dǎo)教師姓名、職稱：許楊 教授 申請(qǐng)學(xué)位的學(xué)科門類：工學(xué) 學(xué)科專業(yè)

3、名稱：發(fā)酵工程 論文答辯日期：2014 年 5 月 30 日 答辯委員會(huì)主席： 評(píng)閱人： 2014 年 5 月 30 日摘要 I 摘要 摘要 1 單域重鏈抗體和堿性磷酸酶的表達(dá)和酶活分析 單域重鏈抗體(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody, VHH)是指僅由重鏈抗體可變區(qū)(Variable region)組成的基

4、因工程抗體。 和普通抗體及重組單鏈抗體(single chain fragment variable, scFv)相比， 單域重鏈抗體具有分子小、水溶性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、易于表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究對(duì)單域重鏈抗體和堿性磷酸酶進(jìn)行了克隆表達(dá)，優(yōu)化了外部表達(dá)條件，對(duì)其進(jìn)行了純化，然后測(cè)定了單域重鏈抗體的結(jié)合力和堿性磷酸酶的比活力，為其應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容如下： 1.1 單域重鏈抗體和堿性磷酸酶克隆和表達(dá) 通過(guò)對(duì)目的蛋白

5、的表達(dá)位置，菌種的遺傳背景進(jìn)行分析，目的蛋白于pET25b(+)載體，Origami B (E.coli)菌種中以可溶性形式表達(dá)。 1.2 單域重鏈抗體和堿性磷酸酶外部表達(dá)條件的優(yōu)化和純化 優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)溫度和裝液量后，目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件最佳為誘導(dǎo)溫度30 ℃，裝液量 70 %，2 %乳糖誘導(dǎo)表達(dá)，然后利用 HisTrapTM HP 瓊脂糖樹(shù)脂預(yù)裝柱純化目的蛋白，對(duì)純化的蛋白通過(guò) BCA 方法對(duì)蛋白含量進(jìn)行測(cè)定，分析結(jié)果顯示：抗鼠免疫球

6、蛋白 G Fc 段單域重鏈抗體 T9 蛋白產(chǎn)量為 50 mg/L，抗鼠免疫球蛋白 G Fc 段單域重鏈抗體 T10 蛋白產(chǎn)量為 10 mg/L，T9-AP 蛋白產(chǎn)量為26 mg/L，T10-AP 蛋白產(chǎn)量為 6 mg/L。 1.3 單域重鏈抗體親和力和堿性磷酸酶酶活力分析 用間接 ELISA 方法， 計(jì)算得到 KT9= 2.5× 107 L/M， KT10= 6× 107 L/M， KT9-AP= 1.96×

7、; 107 L/M， KT10-AP= 2.96× 107 L/M， 親和常數(shù)證明目的蛋白均可以滿足實(shí)際生產(chǎn)需求。利用紫外分光光度計(jì)方法，計(jì)算出野生型堿性磷酸酶比活力為 224 U/mg，T9-AP 的堿性磷酸酶比活力為 34.85 U/mg，T10-AP 的堿性磷酸酶比活力為 36.12 U/mg，重組蛋白 T9-AP 和 T10-AP 的堿性磷酸酶活力降低。 2 大腸桿菌遺傳操作系統(tǒng)改造的研究 快速，高效的基因敲除方法是研