中藥學(xué)之第九章、發(fā)酵工藝控制

1、第八章、發(fā)酵工藝控制,本章內(nèi)容：第一節(jié)、發(fā)酵過(guò)程中的主要控制參數(shù)第二節(jié)、發(fā)酵過(guò)程中的代謝變化第三節(jié)、菌體濃度影響及其控制第四節(jié)、基質(zhì)的影響及其控制第五節(jié)、溫度的影響及其控制第六節(jié)、pH的影響及其控制第七節(jié)、溶氧的影響及其控制第八節(jié)、二氧化碳的影響及其控制第九節(jié)、補(bǔ)料的作用和控制第十節(jié)、泡沫的影響及其控制第十一節(jié)、發(fā)酵終點(diǎn)的判斷,了解發(fā)酵工藝過(guò)程控制的重要性,發(fā)酵是一種很復(fù)雜的生化過(guò)程，其好壞涉及諸多因素。除了菌種的

2、生產(chǎn)性能，還與培養(yǎng)基的配比、原料的質(zhì)量、滅菌條件、種子的質(zhì)量、發(fā)酵條件、過(guò)程控制等有密切的關(guān)系。由于高產(chǎn)菌種對(duì)工藝條件的波動(dòng)比低產(chǎn)菌種更敏感，通常菌種的生產(chǎn)性能越高，其生產(chǎn)條件越難滿足。發(fā)酵生產(chǎn)受許多因素的影響和工藝條件的制約，故掌握生產(chǎn)菌種的代謝規(guī)律和發(fā)酵調(diào)控的基本知識(shí)對(duì)生產(chǎn)的穩(wěn)定和提高具有重要的意義。,第一節(jié)、發(fā)酵過(guò)程中的主要控制參數(shù),本節(jié)內(nèi)容: 一、物理參數(shù)二、化學(xué)參數(shù)三、生物參數(shù),參數(shù)可以反映發(fā)酵工藝的變化,影響發(fā)酵的

3、因素太多。有些因素還是未知的，且其主要影響因素也會(huì)變化。因此了解發(fā)酵工藝條件對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響和掌握反映菌的生理代謝和發(fā)酵過(guò)程變化的規(guī)律，可以幫助人們有效地控制微生物的生長(zhǎng)和生產(chǎn)。與微生物發(fā)酵有關(guān)的參數(shù)，可分為物理、化學(xué)和生物三類。,參數(shù)控制流程,常用工業(yè)發(fā)酵儀器,一、物理參數(shù),溫度（℃）壓力（Pa）攪拌轉(zhuǎn)速(r/min)攪拌功率（kW） 空氣流量（V/(V·min)）粘度（Pa·s 或kg.s/m2）濁

4、度（％）料液流量（L／min）,二、化學(xué)參數(shù),1．pH（酸堿度）2．基質(zhì)濃度（g或mg％）3．溶解氧濃度（ppm或飽和度，％）4．氧化還原電位（mV）5．產(chǎn)物的濃度（μg（u）／ml）6. 廢氣中的氧濃度（Pa）7. 廢氣中的CO2濃度（％）細(xì)胞生物活性的其它化學(xué)參數(shù)：如NAD－NADH體系、ATP－ADP－AMP體系、DNA、RNA、生物合成的關(guān)鍵酶等,三、生物參數(shù),1．菌絲形態(tài) 絲狀菌發(fā)酵過(guò)程中菌絲形態(tài)的改變是生化

5、代謝變化的反映。一般都以菌絲形態(tài)作為衡量種子質(zhì)量、區(qū)分發(fā)酵階段、控制發(fā)酵過(guò)程的代謝變化和決定發(fā)酵周期的依據(jù)之一。2．菌體濃度 菌體濃度的大小和變化速度對(duì)菌體的生化反應(yīng)都有影響。在生產(chǎn)上，常常根據(jù)菌體濃度來(lái)決定適合的補(bǔ)料量和供氧量，以保證生產(chǎn)達(dá)到預(yù)期的水平。,第二節(jié)、發(fā)酵過(guò)程中的代謝變化,本節(jié)內(nèi)容:一、分批發(fā)酵二、補(bǔ)料—分批發(fā)酵三、半連續(xù)（發(fā)酵液帶放）四、連續(xù)發(fā)酵,一. 分批發(fā)酵,1. 分批發(fā)酵的基礎(chǔ)理論分批發(fā)酵的物料平衡微

6、分方程：,X為菌體濃度 g/Lt為培養(yǎng)時(shí)間 h μ為比生長(zhǎng)速率 h-1 S為基質(zhì)濃度 g/Lqs為比基質(zhì)消耗速率 g/（g.h)p為產(chǎn)物濃度 g/Lqp為比產(chǎn)物形成速率 g/(g.h),分批發(fā)酵過(guò)程一般可粗分為四期，即適應(yīng)（停滯）期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)穩(wěn)定期和死亡期,比生長(zhǎng)速度μ,式中X0為菌的初始濃度；Xt為經(jīng)過(guò)培養(yǎng)時(shí)間t的菌度。將菌體濃度的自然對(duì)數(shù)與時(shí)間作圖可得一直線，其斜率為μ，即比生長(zhǎng)速率。,生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型和非生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型

7、,(1). 生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型 根據(jù)產(chǎn)物的形成是否與菌體生長(zhǎng)同步關(guān)聯(lián)，將產(chǎn)物形成動(dòng)力學(xué)分為生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型和非生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型。一般，初級(jí)代謝產(chǎn)物的形成與生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)；而次級(jí)代謝產(chǎn)物的形成與生長(zhǎng)無(wú)關(guān)。(2). 非生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型 此類型的產(chǎn)物形成只與細(xì)胞的積累量有關(guān)，而與產(chǎn)物形成速率與菌的生長(zhǎng)速率無(wú)關(guān)。次級(jí)代謝產(chǎn)物中的一些抗生素的產(chǎn)物合成即屬于這一類。,殺假絲菌素分批發(fā)酵中的葡萄糖耗，DNA含量和殺假絲菌素合成的變化,2. 分批發(fā)酵的重要生長(zhǎng)參

8、數(shù),A B X＝Y(jié)（S0－St）S0為初始基質(zhì)濃度，g／LSt為經(jīng)培養(yǎng)時(shí)間t的基質(zhì)濃度Y為得率系數(shù)，g細(xì)胞/g基質(zhì),C D μ＝μmaxS/(KS＋S)μmax是最大比生長(zhǎng)速率，h-1；KS為基質(zhì)利用常數(shù)，相當(dāng)于μ＝μmax／2時(shí)的基質(zhì)濃度，g／L,,,3. 分批發(fā)酵的優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)： 即操作簡(jiǎn)單，周期短，染菌的機(jī)會(huì)減少和生產(chǎn)過(guò)程、產(chǎn)品質(zhì)量易掌握。 缺點(diǎn)：

9、 存在基質(zhì)抑制問(wèn)題，出現(xiàn)二次生長(zhǎng)（diauxic growth）現(xiàn)象。如對(duì)基質(zhì)濃度敏感的產(chǎn)物，或次級(jí)代謝物，抗生素，用分批發(fā)酵不合適，因其周期較短，一般在1～2天，產(chǎn)率較低。,二. 補(bǔ)料(流加)-分批(fed-batch)發(fā)酵,1. 補(bǔ)料-分批發(fā)酵的理論基礎(chǔ) 由于只有料液的輸入，沒(méi)有輸出，因此，發(fā)酵液的體積在增加。若分批培養(yǎng)中的細(xì)胞生長(zhǎng)受一種基質(zhì)濃度的限制，則在任一時(shí)間的菌濃可用式表示： Xt＝X0+Y（S0－S

10、t） 在St接近S0時(shí)補(bǔ)料，輸入的基質(zhì)等于細(xì)胞消耗的基質(zhì)。故dS／dt＝0，雖培養(yǎng)液中的總菌置XT隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，但細(xì)胞濃度Xt并未提高，即dX／dt＝0，這種情況稱為準(zhǔn)穩(wěn)態(tài)。隨時(shí)間的延長(zhǎng)，稀釋速率將隨體積的增加而減少。,2. 分批補(bǔ)料的優(yōu)點(diǎn),與傳統(tǒng)的分批發(fā)酵相比，優(yōu)點(diǎn)在于使發(fā)酵系統(tǒng)中維持很低的基質(zhì)濃度。低基質(zhì)濃度的優(yōu)點(diǎn)：（1）可以除去快速利用碳源的阻遏效應(yīng)，并維持適當(dāng)?shù)木w濃度，使不至于加劇供氧的矛盾；（2）克服養(yǎng)

11、分的不足，避免發(fā)酵過(guò)早結(jié)束。,三、 半連續(xù)發(fā)酵,在補(bǔ)料-分批發(fā)酵的基礎(chǔ)上加上間歇放掉部分發(fā)酵液（行業(yè)中稱為帶放）便可稱為半連續(xù)發(fā)酵。帶放是指放掉的發(fā)酵液和其他正常放罐的發(fā)酵液一起送去提煉工段。放掉部分發(fā)酵液，再補(bǔ)入適當(dāng)料液不僅補(bǔ)充養(yǎng)分和前體而且代謝有害物被稀釋，從而有利于產(chǎn)物的繼續(xù)合成。,半連續(xù)發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn),（1）可以除去快速利用碳源的阻遏效應(yīng)，并維持適當(dāng)?shù)木w濃度，使不至于加劇供氧的盾。（2）克服養(yǎng)分的不足，避免發(fā)酵過(guò)早結(jié)束。（

12、3）緩解有害代謝產(chǎn)物的積累,半連續(xù)發(fā)酵的不足,①放掉發(fā)酵液的同時(shí)也丟失了未利用的養(yǎng)分和處于生產(chǎn)旺盛期的菌體；②定期補(bǔ)充和帶放使發(fā)酵液稀釋，送去提煉的發(fā)酵液體積更大；③發(fā)酵液被稀釋后可能產(chǎn)生更多的代謝有害物，最終限制發(fā)酵產(chǎn)物的合成；④一些經(jīng)代謝產(chǎn)生的前體可能丟失；⑤有利于非產(chǎn)生菌突變株的生長(zhǎng)。,四、 連續(xù)發(fā)酵,連續(xù)培養(yǎng)是發(fā)酵過(guò)程中一邊補(bǔ)入新鮮的料液，一邊以相近的流速放料，維持發(fā)酵液原來(lái)的體積。1、 單級(jí)連續(xù)發(fā)酵的理論基礎(chǔ)

13、可用D來(lái)表示其稀釋速率（h-1）： D=F／V F為料液流速，L／h V為發(fā)酵液的體積，L 在一定時(shí)間內(nèi)細(xì)胞濃度的凈變化dX／dt為： dX／dt＝μX－DX μX為生長(zhǎng)速率，g／（L·h） DX為細(xì)胞排放速率，g／（L·h）,在穩(wěn)態(tài)條件下dX／dt,dX／dt＝0，即μX＝DX，故μ＝D，即在穩(wěn)態(tài)條件下可通過(guò)補(bǔ)料

14、速率來(lái)控制比生長(zhǎng)速率，因V不變。以μ＝μmax S/（Ks+S）代入 dX／dt＝μX－DX 得： dX/dt＝[(μmaxS)/（Ks+S）－D]X KS為基質(zhì)利用常數(shù)，相當(dāng)于μ＝μmax／2時(shí)的基質(zhì)濃度，g／L,在穩(wěn)態(tài)條件下殘留基質(zhì)濃度的凈變化dS／dt,dS／dt＝基質(zhì)的輸入-基質(zhì)的輸出-細(xì)胞的消耗 dS/dt＝DS0一DS一XμmaxS/[Y(Ks+S)] 在穩(wěn)態(tài)下，dX/dt＝dS/dt＝0 S＝

15、KsD/(μmax－D)Y為得率系數(shù)，g細(xì)胞/g基質(zhì)KS為基質(zhì)利用常數(shù)，相當(dāng)于μ＝μmax／2時(shí)的基質(zhì)濃度，g／L X和S分別為穩(wěn)態(tài)細(xì)胞濃度和穩(wěn)態(tài)殘留基質(zhì)濃度,式S＝KsD/(μmax－D)解釋了D如何控制μ。,細(xì)胞生長(zhǎng)將導(dǎo)致基質(zhì)濃度下降，直到殘留基質(zhì)濃度等于能維持μ＝D的基質(zhì)濃度。如基質(zhì)濃度消耗到低于能支持相關(guān)生長(zhǎng)速率的水平，細(xì)胞的丟失速率將大于生成的速率，這樣S將會(huì)提高，導(dǎo)致生長(zhǎng)速率的增加，平衡又恢復(fù)。,2、 多級(jí)連續(xù)培養(yǎng),基

16、本恒化器的改進(jìn)有多種方法，但最普通的辦法是增加罐的級(jí)數(shù)和將菌體送回罐內(nèi)。,恒化器,連續(xù)培養(yǎng)濃縮菌體兩種辦法：,①限制菌體從恒化器中排出，讓流出的菌體濃度比罐內(nèi)的??；②將流出的發(fā)酵液送到菌體分離設(shè)備中，如讓其沉積或?qū)⑵潆x心，再將部分濃縮的菌體送回罐內(nèi)。部分菌體返回罐內(nèi)的凈效應(yīng)為：罐內(nèi)的菌體濃度增加了；這導(dǎo)致殘留基質(zhì)濃度比簡(jiǎn)單恒化器小；菌體和產(chǎn)物的最大產(chǎn)量增加；臨界稀釋速率也提高。菌體反饋恒化器能提高基質(zhì)的利用率，可以改進(jìn)料液濃度不同的系

17、統(tǒng)的穩(wěn)定性，適用于被處理的料液較稀的品種，如釀造和廢液處理。,3、 連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn),連續(xù)培養(yǎng)有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）維持低基質(zhì)濃度：可以除去快速利用碳源的阻遏效應(yīng)，并維持適當(dāng)?shù)木w濃度，使不至于加劇供氧的矛盾；（2）避免培養(yǎng)基積累有毒代謝物；（3）可以提高設(shè)備利用率和單位時(shí)間的產(chǎn)量，節(jié)省發(fā)酵罐的非生產(chǎn)時(shí)間；（4）便于自動(dòng)控制。,連續(xù)培養(yǎng)也有缺點(diǎn)：,（1）長(zhǎng)時(shí)間的連續(xù)培養(yǎng)難以保證純種培養(yǎng)；（2）菌種發(fā)生變異的可能性較大,第三節(jié)、菌體

18、濃度影響及其控制,本節(jié)內(nèi)容:一、影響菌生長(zhǎng)速率的因素二、菌濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物得率的影響三、菌濃度的控制,菌體（細(xì)胞）濃度,菌體（細(xì)胞）濃度（簡(jiǎn)稱菌濃，cell concentration）是指單位體積培養(yǎng)液中菌體的含量。,一、影響菌生長(zhǎng)速率的因素,1、 菌濃的大小與菌體生長(zhǎng)速率有密切關(guān)系。 典型的細(xì)菌、酵母、霉菌和原生動(dòng)物的倍增時(shí)間分別為45分鐘、90分鐘、3小時(shí)和6小時(shí)左右。2、菌體的增長(zhǎng)與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境條件有密切關(guān)系,二

19、、菌濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物得率的影響,①發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)率與菌體濃度成正比關(guān) 系②菌濃過(guò)高則會(huì)產(chǎn)生不利的影響 攝氧速率與傳氧速率相平衡時(shí)的菌體濃度，是臨界菌體濃度,三、菌濃度的控制,控制菌濃的方法： 菌體的生長(zhǎng)速率，在一定的培養(yǎng)條件下，主要受營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)濃度的影響，所以要依靠調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的濃度來(lái)控制菌濃。1、首先要確定基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方中有個(gè)適當(dāng)?shù)呐浔龋员苊猱a(chǎn)生過(guò)濃（或過(guò)?。┑木w量2、然后通過(guò)中間補(bǔ)料來(lái)控制，如當(dāng)菌體生長(zhǎng)緩慢、菌濃

20、太稀時(shí)，則可補(bǔ)加一部分磷酸鹽，促進(jìn)生長(zhǎng)，提高菌濃；但補(bǔ)加過(guò)多，則會(huì)使菌體過(guò)分生長(zhǎng)，超過(guò)臨界濃度，對(duì)產(chǎn)物合成產(chǎn)生抑制作用。3、利用菌體代謝產(chǎn)生的CO2量來(lái)控制生產(chǎn)過(guò)程的補(bǔ)糖量，以控制菌體的生長(zhǎng)和濃度,第四節(jié)、基質(zhì)的影響及其控制,本節(jié)內(nèi)容:一、碳源的種類和濃度影響和控制二、氮源的種類和濃度影響和控制三、磷酸鹽濃度的影響和控制,基質(zhì)的影響及其控制,基質(zhì)是產(chǎn)生菌代謝的物質(zhì)基礎(chǔ)，既涉及菌體的生長(zhǎng)繁殖，又涉及代謝產(chǎn)物的形成。

21、它們及其代謝產(chǎn)物又是許多調(diào)節(jié)控制機(jī)制的效應(yīng)劑，也影響產(chǎn)物的形成。,一、碳源的種類和濃度影響和控制,1）、迅速利用的碳源：葡萄糖、蔗糖等。迅速參與代謝、合成菌體和產(chǎn)生能量，并產(chǎn)生分解產(chǎn)物，有利于菌體生長(zhǎng)，但有的分解代謝產(chǎn)物對(duì)產(chǎn)物的合成可能產(chǎn)生阻遏作用 。,2）、緩慢利用的碳源,緩慢利用的碳源：多數(shù)為聚合物、淀粉等。為菌體緩慢利用，有利于延長(zhǎng)代謝產(chǎn)物的合成，特別有利于延長(zhǎng)抗生素的分泌期，也有許多微生物藥物的發(fā)酵所采用。在工業(yè)上，發(fā)酵培

22、養(yǎng)基中常采用含迅速和緩慢利用的混合碳源,二、氮源的種類和濃度影響和控制,（1）迅速利用的氮源：氨基（或銨）態(tài)氮的氨基酸（或硫酸銨等）、玉米漿容易被菌體利用，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，但對(duì)某些代謝產(chǎn)物的合成特別是某些抗生素的合成產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，影響產(chǎn)量,2）緩慢利用的氮源,延長(zhǎng)代謝產(chǎn)物的分泌期、提高產(chǎn)物的產(chǎn)量；但一次投入也容易促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和養(yǎng)分過(guò)早耗盡，以致菌體過(guò)早衰老而自溶，縮短產(chǎn)物的分泌期。發(fā)酵培養(yǎng)基一般選用含有快速和慢速利用的混合氮源，還要在發(fā)

23、酵過(guò)程中補(bǔ)加氮源來(lái)控制濃度。補(bǔ)加有機(jī)氮源，如酵母汁、玉米漿、尿素；補(bǔ)加無(wú)機(jī)氮源，如氨水或硫酸銨。,三、磷酸鹽濃度的影響和控制,菌體生長(zhǎng)所允許的濃度比次級(jí)代謝產(chǎn)物合成所允許的濃度就大得多。對(duì)于初級(jí)代謝來(lái)說(shuō)，要求不如次級(jí)代謝那樣嚴(yán)格。對(duì)抗生素發(fā)酵來(lái)說(shuō)，常常是采用生長(zhǎng)亞適量(對(duì)菌體生長(zhǎng)不是最適合但又不影響生長(zhǎng)的量)的磷酸鹽濃度,,總的來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)基過(guò)于豐富，會(huì)使菌生長(zhǎng)過(guò)盛，發(fā)酵液非常黏稠，傳質(zhì)狀況很差。細(xì)胞不得不花費(fèi)許多能量來(lái)維持其生存環(huán)境

24、，即用于非生產(chǎn)的能量倍增，對(duì)產(chǎn)物的合成不利。除上述主要基質(zhì)外，還有其它培養(yǎng)基成分影響發(fā)酵。如Cu2+，在以醋酸為碳源的培養(yǎng)基中，能促進(jìn)谷氨酸產(chǎn)量的提高，Mn2+對(duì)芽孢桿菌合成桿菌肽等次級(jí)代謝產(chǎn)物具有特殊的作用，必須使用足夠的濃度才能促進(jìn)它們的合成等。有關(guān)前體物質(zhì)濃度的控制放在各論中進(jìn)行討論。,第五節(jié)、溫度的影響及其控制,本節(jié)內(nèi)容:一、溫度對(duì)發(fā)酵的影響二、影響發(fā)酵溫度變化的因素三、溫度的控制,一、溫度對(duì)發(fā)酵的影響,微生物藥品發(fā)酵所

25、用的菌體絕大多數(shù)是中溫菌，如霉菌、放線菌和一般細(xì)菌。它們的最適生長(zhǎng)溫度一般在20～40℃。,,溫度的變化對(duì)發(fā)酵過(guò)程可產(chǎn)生兩方面的影響：一方面是影響細(xì)胞的各種代謝過(guò)程，包括各種酶反應(yīng)的速率和蛋白質(zhì)的性質(zhì)另一方面是影響發(fā)酵液的物理性質(zhì)。,,1.能改變菌體代謝產(chǎn)物的合成方向，溫度變化還對(duì)多組分次級(jí)代謝產(chǎn)物的組分比例產(chǎn)生影響2.影響碳源基質(zhì)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞的得率3.幾乎所有微生物的脂質(zhì)成分均隨生長(zhǎng)溫度變化4.影響發(fā)酵液的粘度、基質(zhì)和氧在發(fā)酵

26、液中的溶解度和傳遞速率、某些基質(zhì)的分解和吸收速率等,圖示：溫度對(duì)細(xì)胞得率和脂肪組分的影響,二、影響發(fā)酵溫度變化的因素,1、產(chǎn)熱因素：生物熱（Q生物）、攪拌熱（Q攪拌）2、散熱因素：蒸發(fā)熱（Q蒸發(fā)）、輻射熱（Q輻射）、顯熱（Q顯）3、發(fā)酵熱（Q發(fā)酵）是發(fā)酵溫度變化的主要因素。Q發(fā)酵＝Q生物＋Q攪拌－Q蒸發(fā)－Q輻射－Q顯由于Q生物、Q蒸發(fā)和Q顯，特別是Q生物在發(fā)酵過(guò)程中隨時(shí)間變化，因此發(fā)酵熱在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中也隨時(shí)間變化，引起發(fā)酵

27、溫度發(fā)生波動(dòng)。,三、溫度的控制,1、最適溫度的選擇在生長(zhǎng)階段，應(yīng)選擇最適生長(zhǎng)溫度；在產(chǎn)物分泌階段，應(yīng)選擇最適生產(chǎn)溫度。發(fā)酵溫度可根據(jù)不同菌種、不同產(chǎn)品進(jìn)行選擇。,2、溫度的控制,工業(yè)生產(chǎn)上，所用的大發(fā)酵罐在發(fā)酵過(guò)程中一般不需要加熱，因發(fā)酵中釋放了大量的發(fā)酵熱，需要冷卻的情況較多。利用自動(dòng)控制或手動(dòng)調(diào)整的閥門(mén)，將冷卻水通入發(fā)酵罐的夾層或蛇行管中，通過(guò)熱交換來(lái)降溫，保持恒溫發(fā)酵。如果氣溫較高（特別是我國(guó)南方的夏季氣溫），冷卻水的溫

28、度又高，致使冷卻效果很差，達(dá)不到預(yù)定的溫度，就可采用冷凍鹽水進(jìn)行循環(huán)式降溫，以迅速降到最適溫度。因此大工廠需要建立冷凍站，提高冷卻能力，以保證在正常溫度下進(jìn)行發(fā)酵。,第六節(jié)、pH的影響及其控制,本節(jié)內(nèi)容:一、pH對(duì)發(fā)酵的影響二、pH的變化三、發(fā)酵pH的確定和控制,一、pH對(duì)發(fā)酵的影響,1、影響酶的活性，當(dāng)pH值抑制菌體中某些酶的活性時(shí)，會(huì)阻礙菌體的新陳代謝；2、影響微生物細(xì)胞膜所帶電荷的狀態(tài)，改變細(xì)胞膜的通透性，影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)

29、物的吸收和代謝產(chǎn)物的排泄；3、影響培養(yǎng)基中某些組分的解離，進(jìn)而微生物對(duì)這些成分的吸收；4、pH值不同，往往引起菌體代謝過(guò)程的不同，使代謝產(chǎn)物的質(zhì)量和比例發(fā)生改變。,二、pH的變化,在發(fā)酵過(guò)程中，隨著菌種對(duì)培養(yǎng)基種碳、氮源的利用，隨著有機(jī)酸和氨基酸的積累，會(huì)使pH值產(chǎn)生一定的變化。1、生長(zhǎng)階段：菌體產(chǎn)生蛋白酶水解培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)，生成銨離子，使pH上升至堿性；隨著菌體量增多，銨離子的消耗也增多，另外糖利用過(guò)程中有機(jī)酸的積累使pH值下

30、降。2、生產(chǎn)階段：這個(gè)階段pH值趨于穩(wěn)定。3、自溶階段：隨著養(yǎng)分的耗盡，菌體蛋白酶的活躍，培養(yǎng)液中氨基氮增加，致使pH又上升，此時(shí)菌體趨于自溶而代謝活動(dòng)終止。,,由此可見(jiàn)，在適合于菌生長(zhǎng)及合成產(chǎn)物的環(huán)境條件下，菌體本身具有一定的調(diào)節(jié)pH的能力，但是當(dāng)外界條件變化過(guò)于劇烈，菌體就失去了調(diào)節(jié)能力，培養(yǎng)液的pH就會(huì)波動(dòng) 。,引起發(fā)酵液pH值異常波動(dòng)的因素,1、pH下降：（1）培養(yǎng)基中碳、氮比例不當(dāng)。碳源過(guò)多，特別是葡萄糖過(guò)量，或者中間補(bǔ)

31、糖過(guò)多加上溶氧不足，致使有機(jī)酸大量積累而pH下降；（2）消泡劑加得過(guò)多；（3）生理酸性物質(zhì)的存在，銨被利用，pH下降。2、pH上升：（1）培養(yǎng)基中碳、氮比例不當(dāng)。氮源過(guò)多，氨基氮釋放，使pH上升；（2）生理堿性物質(zhì)存在；（3）中間補(bǔ)料氨水活尿素等堿性物質(zhì)加入過(guò)多。,三、發(fā)酵pH的確定和控制,1、發(fā)酵pH值的確定 細(xì)菌和放線菌在6.5～7.5，酵母在4～5，霉菌在5～7生長(zhǎng)，最適溫度高的菌種，其最適pH也相應(yīng)高一些。

32、 最適pH值是根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)確定的 。,實(shí)驗(yàn)測(cè)定最適pH值的：,例如：將發(fā)酵培養(yǎng)基調(diào)節(jié)成不同的出發(fā)pH值，進(jìn)行發(fā)酵，在發(fā)酵過(guò)程中，定時(shí)測(cè)定和調(diào)節(jié)pH值，以分別維持出發(fā)pH值，或者利用緩沖液來(lái)配制培養(yǎng)基來(lái)維持 ，到時(shí)觀察菌體的生長(zhǎng)情況，以菌體生長(zhǎng)達(dá)到最高值的pH值為菌體生長(zhǎng)的合適pH值。用同樣的方法，可測(cè)得產(chǎn)物合成的合適pH值。,2、pH值的控制,（1）首先考慮和試驗(yàn)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)配方，使它們有個(gè)適當(dāng)?shù)呐浔龋拱l(fā)酵過(guò)程中的pH

33、值變化在合適的范圍內(nèi)。（2）在發(fā)酵過(guò)程中直接補(bǔ)加酸或堿和補(bǔ)料的方式來(lái)控制；補(bǔ)充生理酸性物質(zhì)（如(NH4)2SO4）和生理堿性物質(zhì)（如NaNO3）來(lái)控制。,第七節(jié)、溶氧的影響及其控制,本節(jié)內(nèi)容:一、溶氧的影響二、發(fā)酵過(guò)程的溶氧變化三、溶氧濃度的控制,前言,在發(fā)酵過(guò)程中有多方面的限制因素，而溶氧往往是最易成為控制因素。工業(yè)發(fā)酵中產(chǎn)率是否受氧的限制，單憑通氣量的大小是難以確定的。因溶氧的高低不僅取決于供氧、通氣攪拌等，還取決于需氧狀況

34、。從溶氧變化的情況可以了解氧的供需規(guī)律及其對(duì)生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的影響。常用的測(cè)氧方法主要是基于極譜原理的電流型測(cè)氧覆膜電極。,一、溶氧的影響,在發(fā)酵過(guò)程中，影響耗氧的因素有以下幾方面：1、培養(yǎng)基的成分和濃度2、菌齡3、發(fā)酵條件,二、發(fā)酵過(guò)程的溶氧變化,生長(zhǎng)過(guò)程從培養(yǎng)液中溶氧濃度的變化可以反映菌的生長(zhǎng)生理狀況 ：通常，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期溶氧明顯下降，從其下降的速率可估計(jì)菌的大致生長(zhǎng)情況。,三、溶氧濃度的控制,在供氧方面，主要是設(shè)法提高氧傳遞

35、的推動(dòng)力和液相體積氧傳遞系數(shù)。1、調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速或通氣速率來(lái)控制供氧；2、控制補(bǔ)料速度來(lái)控制基質(zhì)的濃度，從而達(dá)到最適的菌體濃度，保證產(chǎn)物的比生長(zhǎng)速率維持在最大值，又不會(huì)使需氧大于供氧。3、采用調(diào)節(jié)溫度（降低培養(yǎng)溫度可提高溶氧濃度）、液化培養(yǎng)基、中間補(bǔ)水、添加表面活性劑等工藝措施，來(lái)改善溶氧水平。,第八節(jié)、二氧化碳的影響及其控制,本節(jié)內(nèi)容:一、二氧化碳的來(lái)源和影響二、二氧化碳濃度的控制,一、二氧化碳的來(lái)源和影響,1、 CO2來(lái)源：

36、 CO2是呼吸和分解代謝的終產(chǎn)物。幾乎所有酵均產(chǎn)生大量CO2，例如，在產(chǎn)黃青霉的生長(zhǎng)產(chǎn)物形成中的CO2來(lái)源可用下式表示：菌體生長(zhǎng)：,CO2來(lái)源,2. CO2的影響,(1) CO2對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響 CO2對(duì)微生物生長(zhǎng)和發(fā)酵具有刺激或抑制作用，此現(xiàn)象稱為CO2效應(yīng)。 CO2受限制可能導(dǎo)致適應(yīng)(停滯)期的延長(zhǎng)；菌絲形態(tài)隨CO2含量不同而改變。(2) CO2對(duì)產(chǎn)物合成的影響

37、 促進(jìn)或抑制作用。即使供氧已足夠，還應(yīng)考慮通氣量，需降低發(fā)酵液中CO2的濃度。(3) CO2對(duì)細(xì)胞的作用機(jī)制 CO2及HCO3都影響細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，改變膜的流動(dòng)性及表面電荷密度，影響細(xì)胞膜的運(yùn)輸效率，改變細(xì)胞形態(tài)。,二、二氧化碳濃度的控制,1、 CO2濃度大小受到菌體的呼吸強(qiáng)度、發(fā)酵液流變學(xué)特性、通氣攪拌程度和外界壓力大小等許多因素影響 罐內(nèi)的CO2分壓是液體深度的函數(shù)，CO2的溶解度隨壓力增加而增大。2、CO2濃度的

38、控制應(yīng)隨它對(duì)發(fā)酵的影響而定。通氣和攪拌速率的大小，能調(diào)節(jié)CO2的溶解度。3、CO2的產(chǎn)生與補(bǔ)料工藝控制密切相關(guān)。補(bǔ)糖會(huì)增加排氣中CO2的濃度和降低培養(yǎng)液的pH。4、在青霉素補(bǔ)料工藝的控制參數(shù)中，排氣中的CO2量的變化比pH變化更為敏感，所以采用CO2釋放率作為控制補(bǔ)糖的參數(shù)。,第九節(jié)、補(bǔ)料的作用和控制,本節(jié)內(nèi)容:一、補(bǔ)料分批培養(yǎng)（FBC)的優(yōu)點(diǎn)和應(yīng)用二、 FBC的作用三、 FBC的補(bǔ)料方式和控制,一、補(bǔ)料分批培養(yǎng)（FBC)的優(yōu)

39、點(diǎn)和應(yīng)用,1、可以解除底物抑制、產(chǎn)物反饋抑制和分解代謝物的阻遏；2、可以避免在分批發(fā)酵中因一次投料過(guò)多造成細(xì)胞大量生長(zhǎng)所引起的影響，改善發(fā)酵流變學(xué)的性質(zhì)；3、可用作控制細(xì)胞質(zhì)量的手段，以提高發(fā)芽孢子的比例；4、可作為理論研究的手段，為自動(dòng)控制和最優(yōu)控制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。,二、 FBC的作用,1、可以控制抑制性底物的濃度高濃度營(yíng)養(yǎng)物對(duì)大多數(shù)微生物生長(zhǎng)是不利的 ：滲透壓過(guò)高；熱致死 ；抑制細(xì)胞組分或酶；改變菌體的生化代謝2、可以解除或

40、減弱分解產(chǎn)物阻遏3、可以使發(fā)酵過(guò)程最佳化,三、 FBC的補(bǔ)料方式和控制,就補(bǔ)料方式而言：連續(xù)流加、不連續(xù)流加、多周期流加 每次流加又可分為：快速流加、恒速流加、指數(shù)速率流加、變速流加從反應(yīng)器數(shù)目分類：?jiǎn)谓M分流加、多組分流加從反應(yīng)器中發(fā)酵體積來(lái)分：有變體積和恒體積之分。從補(bǔ)加培養(yǎng)基的成分來(lái)分，又可分為單組分補(bǔ)料和多組分補(bǔ)料。,1、 補(bǔ)料的策略,優(yōu)化補(bǔ)料速率要根據(jù)微 生物對(duì)養(yǎng)分的消耗速率及所設(shè)定的發(fā)酵液中最低維持濃度而定。

41、不論生物反應(yīng)器的體積傳質(zhì)系數(shù)大小，它們均有一最佳補(bǔ)料速率，補(bǔ)糖速率的最佳點(diǎn)與KLα有關(guān),2、 補(bǔ)料的依據(jù)和時(shí)機(jī)判斷,依據(jù)有：用菌的形態(tài)，比生長(zhǎng)速率，發(fā)酵液中糖濃度，溶氧濃度，尾氣中的氧和CO2含量，攝氧率或呼吸商的變化。不同的發(fā)酵品種有不同的依據(jù)。一般以發(fā)酵液中的殘?zhí)菨舛葹橹笜?biāo)。對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物的發(fā)酵，還原糖濃度一般控制在5g/L左右的水平。也有用產(chǎn)物的形成來(lái)控制補(bǔ)料。如現(xiàn)代酵母生產(chǎn)是藉自動(dòng)測(cè)量尾氣中的微量乙醇來(lái)嚴(yán)格控制糖蜜的流加。,

42、幾種補(bǔ)料依據(jù)介紹-a,a. 糖濃度和溶氧濃度,青霉素補(bǔ)料發(fā)酵：可通過(guò)補(bǔ)料速率的調(diào)節(jié)來(lái)控制生長(zhǎng)和氧耗，使菌處于半饑餓狀態(tài)，使發(fā)酵液有足夠的氧，從而達(dá)到高的青霉素生產(chǎn)速率。加糖可控制對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和生產(chǎn)期的代謝。控制加糖速率使青霉素發(fā)酵處于半饑餓狀態(tài)對(duì)青霉素的合成有利。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期采用計(jì)算機(jī)控制加糖來(lái)維持溶氧和pH在一定范圍內(nèi)可顯著提高青霉素的產(chǎn)率。在青霉素發(fā)酵的生產(chǎn)期溶氧比pH對(duì)青霉素合成的影響更大，因在此期溶氧為控制因素。,幾種補(bǔ)料依據(jù)介

43、紹-b,b. 尾氣中CO2含量,在青霉素發(fā)酵中加糖會(huì)引起尾氣CO2含量的增加和發(fā)酵液的pH下降。糖、CO2、pH三者的相關(guān)性可作為青霉素工業(yè)生產(chǎn)上補(bǔ)料控制的參數(shù)。尾氣的變化比pH更為敏感，可測(cè)定尾氣CO2的釋放率來(lái)控制加糖速度。,幾種補(bǔ)料依據(jù)介紹-c,c. 比生長(zhǎng)速率的影響以細(xì)胞體或初級(jí)代謝物為產(chǎn)物的發(fā)酵需要維持最大的μ來(lái)獲得最大產(chǎn)量。例如面包酵母培養(yǎng)期間維持最大的μ來(lái)獲得最大產(chǎn)量，同時(shí)避免糖濃度高時(shí)由于crabtree效應(yīng)引起

44、乙醇的形成，導(dǎo)致發(fā)酵周期延長(zhǎng)和產(chǎn)量降低?？捎闷咸烟莻鞲衅髟诰€監(jiān)控葡萄糖含量或監(jiān)控乙醇濃度和呼吸商(RQ)隨時(shí)間的延長(zhǎng)，稀釋速率將隨體積的增加而減少，因而補(bǔ)料-分批發(fā)酵的μ是降低的 。在分批補(bǔ)料中為了維持最大μ值，常采用指數(shù)式補(bǔ)料。,Crabtree效應(yīng),Pasteur在研究酵母發(fā)酵時(shí)，發(fā)現(xiàn)在供氧充足的條件下，細(xì)胞內(nèi)糖酵解作用受到抑制。葡萄糖消耗和乳酸生成減少，這種有氧氧化對(duì)糖酵解的抑制作用稱為巴士德效應(yīng)(Pasteur effect)

45、。Crabtree效應(yīng)與巴士德效應(yīng)相反，在癌細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，給予葡萄糖時(shí)不論供氧充足與否，都呈現(xiàn)很強(qiáng)的酵解反應(yīng)，而糖的有氧氧化受抑制，稱為Crabtree效應(yīng)或反巴士德效應(yīng)。這種現(xiàn)象較普遍地存在于癌細(xì)胞中，此外也存在于一些正常組織細(xì)胞如視網(wǎng)膜、睪丸、顆粒白細(xì)胞等。,3、補(bǔ)料的控制方法,1）、 反饋控制系統(tǒng)：由傳感器、控制器和驅(qū)動(dòng)器組成。 分為直接方法和間接方法。 間接方法是以溶氧、pH、呼吸商、排氣中CO2分壓及代謝產(chǎn)物濃度等

46、作為控制參數(shù)。對(duì)間接方法來(lái)說(shuō)，選擇與過(guò)程直接相關(guān)的可檢參數(shù)作為控制指標(biāo)，是研究的關(guān)鍵。 直接方法是直接以限制性營(yíng)養(yǎng)物(如碳源、氮源或C/N等)的濃度作為反饋控制的參數(shù)。直接方法，由于長(zhǎng)期缺乏可靠的適時(shí)測(cè)定手段，無(wú)法控制適時(shí)補(bǔ)料，所以一直沒(méi)有用于發(fā)酵控制。,補(bǔ)料的控制方法-2）無(wú)反饋控制,無(wú)反饋控制指無(wú)固定的反饋控制參數(shù)來(lái)使操作最優(yōu)化的控制。過(guò)去是以經(jīng)驗(yàn)為基礎(chǔ)，后來(lái)才出現(xiàn)嚴(yán)格的數(shù)學(xué)模型。在頭孢菌素C的發(fā)酵研究中，采用計(jì)算機(jī)模擬的辦法

47、，考慮到菌絲的分化、產(chǎn)物的誘導(dǎo)及分解產(chǎn)物對(duì)產(chǎn)物合成的抑制等多種因素，利用歸一法原理，把復(fù)雜的多組分補(bǔ)料問(wèn)題簡(jiǎn)化成各個(gè)單一組分的補(bǔ)料，從而確立了最優(yōu)化的補(bǔ)料方式。經(jīng)模擬試驗(yàn)證實(shí)，采用該補(bǔ)料方式可比分批培養(yǎng)法的產(chǎn)量提高近30%。,第十節(jié)、泡沫的影響及其控制,本節(jié)內(nèi)容:一、泡沫的產(chǎn)生及影響二、發(fā)酵過(guò)程中泡沫消長(zhǎng)規(guī)律三、泡沫的控制,一、泡沫的產(chǎn)生及影響,泡沫是氣體被分散在少量液體中的膠體體系，氣液之間被一層液膜隔開(kāi)，彼此不相連通。泡沫有兩

48、種類型：發(fā)酵液液面上的泡沫和發(fā)酵液中的泡沫，又稱流態(tài)泡沫(fluid foam)。發(fā)酵液的理化性質(zhì)對(duì)形成泡沫的表面現(xiàn)象起決定性的作用：蛋白質(zhì)和細(xì)胞本身具有穩(wěn)定泡沫的作用。,5種起泡的方式：,①整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，泡沫保持恒定的水平；②發(fā)酵早期，起泡后穩(wěn)定地下降，以后保持恒定；③發(fā)酵前期，泡沫稍微降低后又開(kāi)始回升；④發(fā)酵開(kāi)始起泡能力低，以后上升；⑤以上類型的綜合方式。這些方式的出現(xiàn)是與基質(zhì)的種類、通氣攪拌強(qiáng)度和滅菌條件等因素有關(guān)。

49、其中基質(zhì)中的有機(jī)氮源(如黃豆餅粉等)是起泡的主要因素。,起泡給發(fā)酵帶來(lái)的副作用：,①降低了發(fā)酵罐的裝料系數(shù)②增加了菌群的非均一性③增加了污染雜菌的機(jī)會(huì)④大量起泡，會(huì)引起逃液⑤影響通氣攪拌，菌體呼吸受到阻礙⑥消泡劑的加入有時(shí)會(huì)影響發(fā)酵或給提煉工序帶來(lái)麻煩。,二、發(fā)酵過(guò)程中泡沫消長(zhǎng)規(guī)律,發(fā)酵過(guò)程中泡沫的多寡與通氣攪拌的劇烈程度和培養(yǎng)基的成分有關(guān)： 蛋白、黏度 、糖類 、滅菌在發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液的性質(zhì)隨菌的代謝活動(dòng)不斷變化，是泡沫消

50、長(zhǎng)的重要因素。,霉菌發(fā)酵過(guò)程中液體表面性質(zhì)與泡沫壽命的關(guān)系,三、泡沫的控制,兩種途徑：①調(diào)整培養(yǎng)基中的成分，或改變某些物理化學(xué)參數(shù) ，或者改變發(fā)酵工藝 ；②采用機(jī)械消沫或消沫劑消沫 從生產(chǎn)菌種本身的特性著手，預(yù)防泡沫的形成。,1、機(jī)械消沫,利用機(jī)械強(qiáng)烈振動(dòng)或壓力變化而使泡沫破裂，起消沫作用。有罐內(nèi)消沫和罐外消沫兩種方法。該法的優(yōu)點(diǎn)是：節(jié)省原料，不需引進(jìn)外界物質(zhì)(如消泡劑)，減少染菌機(jī)會(huì)，不會(huì)增加下游工段的負(fù)擔(dān)。消沫效果不理想，

51、不能從根本上消除泡沫成因，僅可作為消沫的輔助方法。,2、消沫劑消沫,1）、消沫劑的作用 利用外界加入消沫劑，使泡沫破裂。消沫劑的作用，或者是降低泡沫液膜的機(jī)械強(qiáng)度，或者是降低液膜的表面粘度，或者兼有兩者的作用，達(dá)到破裂泡沫的目的。 消沫劑都是表面活性劑，具有較低的表面張力。 應(yīng)具備的條件：親水性 、大活性、持久 、無(wú)毒性 、不影響提取、無(wú)危害、成本低 、不影響氧傳遞；耐高溫。,2）、消泡劑的種類,常用的消沫劑，主要有天然油脂類，高

52、碳醇、脂肪酸和酯類，聚醚類，硅酮類4大類。天然油酯類和聚醚類在微生物藥物發(fā)酵中最為常用 。,3）、消沫劑的應(yīng)用,消沫劑多數(shù)是溶解度小、分散性不十分好的高(大)分子化合物，要考慮如何降低它的粘度和提高它的分散性增效方法：①加分散劑增效；②消沫劑的并用增效消沫作用的持久性還與加入量和時(shí)機(jī)有關(guān)注意消沫劑對(duì)微生物的影響應(yīng)制成乳濁液，宜與機(jī)械方法聯(lián)合,應(yīng)用消泡劑時(shí)的增效方法：,加載體增效：即用惰性載體（如礦物油、植物油等）使消泡劑溶解分散

53、，達(dá)到增效的目的；消泡劑并用增效：取各種消泡劑的優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行互補(bǔ)，達(dá)到增效（如GP和GPE 1:1混合使用于土霉素發(fā)酵，結(jié)果比單獨(dú)使用GP的效力提高2倍）；乳化消泡劑增效：用乳化劑（或分散劑）將消泡劑制成乳劑，以提高分散能力，增強(qiáng)消泡效力（如用吐溫-80制成的乳劑，用于慶大霉素發(fā)酵，效力提高1～2倍），一般只適用于親水性差的消泡劑。在生產(chǎn)過(guò)程中，消泡的效果除了與消泡劑的種類、性質(zhì)、分子量大小、消泡劑親油親水基團(tuán)等密切香港外，還與消泡劑

54、使用時(shí)加入方法、使用濃度、溫度等有很大關(guān)系，應(yīng)結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際加以注意和解決,第十一節(jié)、發(fā)酵終點(diǎn)的判斷,本節(jié)內(nèi)容:如何確定合理的放罐時(shí)間？要確定一個(gè)合理的放罐時(shí)間，須考慮哪些因素？,如何確定合理的放罐時(shí)間？,必須把追求高生產(chǎn)力和顧及產(chǎn)品的成本二者結(jié)合起來(lái)到了末期，菌體的分泌能力都要下降，菌體衰老而進(jìn)入自溶，釋放出體內(nèi)的分解酶會(huì)破壞已形成的產(chǎn)物。所以必須確定合適的發(fā)酵終點(diǎn)。發(fā)酵類型的不同，要求達(dá)到的目標(biāo)也不同：區(qū)別對(duì)待原材料與發(fā)酵成本

55、占整個(gè)生產(chǎn)成本的主要部分 ，下游提煉成本占主要部分和產(chǎn)品價(jià)值高這幾種不同情況,要確定一個(gè)合理的放罐時(shí)間，須考慮以下因素：,一、經(jīng)濟(jì)因素 以最低的成本來(lái)獲得最大生產(chǎn)能力的時(shí)間為最適發(fā)酵時(shí)間。二、產(chǎn)品質(zhì)量因素 發(fā)酵工藝長(zhǎng)短對(duì)后續(xù)工藝和產(chǎn)品質(zhì)量有很大影響三、特殊因素 1、在正常情況下，可根據(jù)作業(yè)計(jì)劃，按時(shí)放罐； 2、在異常情況下，如染菌、代謝異常（糖耗緩慢等），就應(yīng)根據(jù)不同情況，進(jìn)行適當(dāng)處理，以免倒罐。