第十八章補(bǔ)體檢測(cè)及補(bǔ)體參與的試驗(yàn)

1、第十八章 補(bǔ)體檢測(cè)及補(bǔ)體參與的試驗(yàn),臨床免疫室 黃卓春2018-5-9,補(bǔ)體（complement, C）,是一組存在于人和脊椎動(dòng)物血清、組織液和細(xì)胞膜 表面，具有酶樣活性、不耐熱、功能上連續(xù)反應(yīng)的糖蛋白,可輔助和補(bǔ)充特異性抗體介導(dǎo)的溶菌、溶血作用,補(bǔ)體系統(tǒng)：補(bǔ)體固有成分、補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白、補(bǔ)體受體,含量相對(duì)穩(wěn)定，疾病狀態(tài)時(shí)含量及活性可發(fā)生變化,補(bǔ)體的表達(dá)方式,參與補(bǔ)體激活經(jīng)典途徑的固有成分按其被發(fā)現(xiàn)的先后順序分別稱C1、

2、C2、……C9。C1由C1q、C1r、C1s三種亞單位組成 補(bǔ)體系統(tǒng)旁路激活途徑及調(diào)節(jié)因子中另一些組分以英文大寫(xiě)字母表示，如B因子、D因子、P因子、H因子等；補(bǔ)體調(diào)節(jié)成分多以其功能進(jìn)行命名，如C1抑制物（C1INH）、C4結(jié)合蛋白（C4BP）補(bǔ)體活化后的裂解片段以該成分的符號(hào)后加小寫(xiě)英文字母表示，通常a為 小片段，b為大片段：C2a、C2b具有活性成分的復(fù)合物在其字符上劃一橫線表示，如：C1～C9滅活的補(bǔ)體片段在其字符前加英文

3、字母i表示，如iC3b 對(duì)補(bǔ)體受體以其結(jié)合對(duì)象命名，如CLrR、C5Ar、對(duì)C3片段受體則用CR1、CR2……CR4表示,,,補(bǔ)體系統(tǒng)組成,第一節(jié) 補(bǔ)體的理化特性與生物學(xué)功能,90%的血清補(bǔ)體由肝臟合成,感染部位活化的巨噬細(xì)胞能分泌幾乎所有種類的補(bǔ)體成分,補(bǔ)體的理化特性,血清補(bǔ)體總量約為4g/l，C3含量最高不穩(wěn)定，易受各種理化因素影響（熱不穩(wěn)定，56℃、30min即被滅活；射線、機(jī)械振蕩、酒精、膽汁等可 破壞補(bǔ)體）在0～1

4、0℃活性保持3～4天,,補(bǔ)體系統(tǒng)的激活,1. 經(jīng)典激活途徑（classical pathway，CP)2. 旁路激活途徑 (alternative pathway，AP)3. 甘露聚糖（MBL）激活途徑,1.經(jīng)典激活途徑,抗原抗體復(fù)合物啟動(dòng)的，由C1—C9參與的一系列的酶促反應(yīng)，其結(jié)果是靶細(xì)胞因細(xì)胞膜受攻擊復(fù)合物作用而被裂解,激活物 ：抗原—抗體（IgG、IgM）復(fù)合物 Immunocomplex，IC

5、 循環(huán)免疫復(fù)合物 Circular Immunocomplex，CIC,激活順序：識(shí)別階段-活化階段-膜攻擊階段,2. 旁路途徑的激活,三種補(bǔ)體激活途徑比較,補(bǔ)體系統(tǒng)的生物學(xué)功能,1.溶解細(xì)胞、細(xì)菌和病毒2.調(diào)理作用3.清除免疫復(fù)合物4.引起炎癥反應(yīng)5.免疫調(diào)節(jié)作用,血清總補(bǔ)體活性測(cè)定（CH50試驗(yàn)）:以紅細(xì)胞的溶解為指示，以50%溶血為判斷終點(diǎn)。CP-CH50AP-CH50MBL-CH50,

6、第二節(jié) 血清總補(bǔ)體活性測(cè)定,（一）實(shí)驗(yàn)原理： 特異性抗體與紅細(xì)胞結(jié)合后可激活補(bǔ)體，導(dǎo)致紅細(xì)胞表面形成跨膜小孔，使胞外水分滲入，引起紅細(xì)胞腫脹而發(fā)生溶血，溶血程度與補(bǔ)體的活性有關(guān)，與補(bǔ)體的劑量依賴呈S型曲線。,30%-70%呈直線，50%溶血為終點(diǎn),,,,,,（二）試驗(yàn)方法,紅細(xì)胞濃度的調(diào)整：2%~5%綿羊紅細(xì)胞（SRBC）懸液溶血素的配制：是以SRBC免疫家兔所得的兔抗血清，即兔抗綿羊紅細(xì)胞抗體。試驗(yàn)前要滅活補(bǔ)體及進(jìn)行

7、溶血素的稀釋和滴定。稀釋緩沖液：PH7.2~7.4磷酸鹽緩沖液，必須含有Ca2+、Mg2+,不同稀釋度溶血素的配制,最終稀釋度 稀釋液(ml) 稀釋度 溶血素（ml）1:1000 1.8 1:100 0.21:2000

8、 0.2 1:1000 0.21:3000 0.4 1:1000 0.21:4000 0.2 1:2000 0.21:5000

9、 0.8 1:1000 0.21:6000 0.2 1:3000 0.21:8000 0.2 1:4000 0.2

10、1:10000 0.2 1:5000 0.2,,,,所加溶血素,,溶血素的滴定,1 1：1000 0.1 0.2 0.2 0.1 全溶血2 1：2000 0.1

11、 0.2 0.2 0.1 全溶血3 1：3000 0.1 0.2 0.2 0.1 37℃ 全溶血4 1：4000 0.1 0.2 0.

12、2 0.1 30分鐘 全溶血5 1：5000 0.1 0.2 0.2 0.1 大部分溶血6 1：6000 0.1 0.2 0.2 0.1 微

13、溶血7 1：8000 0.1 0.2 0.2 0.1 不溶血8 1：10000 0.1 0.2 0.2 0.1 不溶血9 對(duì)照 －

14、 － 0.2 0.1 不溶血,管號(hào) 溶血素 試管內(nèi)加入的試劑量（ml） 稀釋度 溶血素 　補(bǔ)體(1:60) 緩沖液 2%SRBC 結(jié)果,,,,,,以最高稀釋度的溶血素仍能產(chǎn)生完全溶血為最大有效反應(yīng)管(1:4000)即為1個(gè)單位，一般試驗(yàn)使

15、用2個(gè)單位(1:2000),50%溶血標(biāo)準(zhǔn)管配制,混勻后取2.5ml，隨試驗(yàn)一起孵育。,,血清總補(bǔ)體50%溶血活性測(cè)定（U/ml）,1 0.10 1.400.5 0.52 0.15 1.350.50.53 0.20 1.300.50.54 0.25 1.250.5

16、0.55 0.30 1.200.50.56 0.35 1.150.50.57 0.40 1.100.50.58 0.45 1.050.50.59 0.50 1.000.50.510 0.00 1.50

17、0.50.5 37℃，30分鐘，2500r/min離心，與50%溶血標(biāo)準(zhǔn)比較,,試管號(hào) 1:20稀釋血清 巴比妥緩沖液 2u溶血素 2%SRBC,,,按以下公式計(jì)算50%溶血的總補(bǔ)體值,CH50（U/ml）= ×稀釋倍數(shù) 總補(bǔ)體活性參

18、考范圍:50-100 U /ml反應(yīng)總體積2.5ml為常用,,1,血清用量,（三）方法評(píng)價(jià),CP-CH50測(cè)定經(jīng)典途徑總補(bǔ)體溶血活性反應(yīng)的是補(bǔ)體9種成分綜合水平方法簡(jiǎn)便、快速，但敏感性較低影響因素多：緩沖液pH 、離子強(qiáng)度、Ca2+、Mg2+濃度等，各個(gè)環(huán)節(jié)嚴(yán)加控制。,主要檢測(cè)的單個(gè)補(bǔ)體成分：C3、C4、C1q、B因子和C1抑制物方法：1. 免疫溶血法 測(cè)定補(bǔ)體的溶血活性2. 免疫化學(xué)法 測(cè)定補(bǔ)體的含量,第三節(jié)

19、 單個(gè)補(bǔ)體成分的測(cè)定,一、免疫溶血法,原理：抗原與特異性抗體結(jié)合后可激活補(bǔ)體的經(jīng)典途徑導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解。當(dāng)缺乏某一單個(gè)補(bǔ)體成分時(shí)，不能使補(bǔ)體連續(xù)激活，指示系統(tǒng)不發(fā)生溶血；加入待測(cè)血清，若含原來(lái)缺乏的補(bǔ)體成分，則級(jí)聯(lián)反應(yīng)恢復(fù)，產(chǎn)生溶血，溶血程度與待測(cè)單個(gè)補(bǔ)體成分活性有關(guān)以50%溶血為終點(diǎn),、溶血素,、溶血素,注:兔紅細(xì)胞可直接活化補(bǔ)體的旁路途經(jīng),二、免疫化學(xué)法,單向免疫擴(kuò)散法火箭免疫電泳透射比濁法速率散射比濁法,免疫濁度測(cè)定（

20、第六章 P67）,可溶性抗原和相應(yīng)抗體特異性結(jié)合（兩者在比例合適和增濁劑作用下），可快速形成較大的免疫復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度?？贵w過(guò)量的情況下，反應(yīng)液的濁度與待測(cè)抗原量呈正相關(guān),透射免疫比濁試驗(yàn)檢測(cè)的是透射光，即免疫復(fù)合物形成后，反應(yīng)液濁度變化，引起透射光的改變抗體用量大，耗時(shí)長(zhǎng)，不宜用于藥物半抗原的檢測(cè),散射免疫比濁試驗(yàn),檢測(cè)的是散射光,終點(diǎn)散射比濁試驗(yàn)——在抗原-抗體反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)測(cè)定散射光強(qiáng)度,速率散射比濁試驗(yàn)——抗原抗體

21、結(jié)合反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)測(cè)定方法，臨床上使用的主要方法學(xué),膠乳增強(qiáng)免疫濁度測(cè)定,利用補(bǔ)體的溶細(xì)胞作用，將其作為試劑成分參與試驗(yàn)可對(duì)各種抗原或抗體以及免疫復(fù)合物進(jìn)行檢測(cè),第四節(jié) 補(bǔ)體參與的試驗(yàn),補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn) complement fixation test, CFT,反映經(jīng)典途徑的抗原抗體反應(yīng)應(yīng)用綿羊紅細(xì)胞和溶血素作指示劑檢測(cè)抗原或抗體,一、試驗(yàn)原理補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)三個(gè)系統(tǒng)反應(yīng)系統(tǒng)：已知抗原（或抗體）與待測(cè)抗體（或抗原）補(bǔ)體系統(tǒng)：

22、豚鼠血清指示系統(tǒng)：與溶血素結(jié)合的致敏綿羊紅細(xì)胞SRBCS,圖19-3,二、方法評(píng)價(jià),靈敏度高 0.05ug/ml特異性強(qiáng)結(jié)果明顯試驗(yàn)條件要求低參與成分多，操作繁瑣,補(bǔ)體參與的其他試驗(yàn),C1q抗體的測(cè)定試驗(yàn)將C1q作為抗原檢測(cè)患者血清中的抗C1q抗體抗C1q抗體是一種自身抗體，臨床上主要用于狼瘡腎炎的診斷和監(jiān)測(cè)，低補(bǔ)體血癥性蕁麻疹性血管炎、膜增生性腎小球腎炎和Felty綜合征（指除有典型的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎臨床表現(xiàn)外，還伴有脾臟腫

23、大和白細(xì)胞計(jì)數(shù)減少的一種嚴(yán)重型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎）的診斷采用ELISA方法檢測(cè),1. 與補(bǔ)體降低相關(guān)的疾病 2. 高補(bǔ)體血癥(心梗和某些惡性腫瘤),第五節(jié) 補(bǔ)體測(cè)定的臨床意義,補(bǔ)體缺陷,在臨床上偶爾可以見(jiàn)到一些補(bǔ)體先天性缺陷的病人，C2缺陷和C1INH缺陷相對(duì)較常見(jiàn)，其它補(bǔ)體成分的缺陷均非常罕見(jiàn)。補(bǔ)體先天性缺陷患者的兩大臨床表現(xiàn)是反復(fù)感染和自身免疫病，這也從反面證實(shí)了補(bǔ)體在抗感染免疫和免疫調(diào)節(jié)方面的重要意義。,補(bǔ)體缺陷的臨床

24、表現(xiàn),C1IHN缺陷引起血管神經(jīng)性水腫,繼發(fā)性補(bǔ)體降低：,消耗增多：SLE、RA、自身免疫性溶血大量丟失：大面積燒傷、失血及腎臟病患者補(bǔ)體合成不足：肝臟疾病或營(yíng)養(yǎng)不良,補(bǔ)體活性及含量的測(cè)定對(duì)自身免疫病的診斷、有無(wú)疾病的活動(dòng)以及疾病的進(jìn)程和療效的判斷等提供重要依據(jù),高補(bǔ)體血癥,偶見(jiàn)感染恢復(fù)期惡性腫瘤急性病毒性肝炎、心肌梗死、糖尿病,補(bǔ)體與病毒感染,補(bǔ)體受體及補(bǔ)體膜表面調(diào)節(jié)蛋白與病毒感染的關(guān)聯(lián)受到越來(lái)越多的重視，一些病毒可通過(guò)補(bǔ)體

25、受體等感染宿主細(xì)胞，例如，EB病毒通過(guò)CR2感染B細(xì)胞，麻疹病毒通過(guò)MCP感染機(jī)體細(xì)胞，柯薩其病毒、?？刹《竞湍c道病毒可通過(guò)DAF感染細(xì)胞等。臨床上可考慮應(yīng)用補(bǔ)體受體的阻斷劑治療某些病毒感染性疾病。,補(bǔ)體與器官移植的超急性排斥,目前研究結(jié)果表明，超急性移植排斥的主要原因是補(bǔ)體系統(tǒng)的全身性激活，導(dǎo)致對(duì)機(jī)體自身的廣泛性組織損傷，產(chǎn)生致命的后果。目前在臨床前研究的解決方案是：（1）利用補(bǔ)體抑制劑如可溶性CR1進(jìn)行藥物治療；（2）考慮應(yīng)

26、用轉(zhuǎn)基因技術(shù)解決這一問(wèn)題。,目前已開(kāi)展了CR1、DAF、CD59、MCP等膜表面補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白轉(zhuǎn)基因豬的實(shí)驗(yàn)研究，將這些人類基因在胚胎期轉(zhuǎn)入豬胚胎細(xì)胞后，使其發(fā)育成含有人類基因的轉(zhuǎn)基因豬，將其器官移植至靈長(zhǎng)類動(dòng)物后，由于補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白對(duì)補(bǔ)體的抑制作用，可有效阻止超急性移植排斥的發(fā)生，使移植的器官存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)。,補(bǔ)體與炎癥性疾病,補(bǔ)體在活化過(guò)程中產(chǎn)生的片段具有一些新的生物學(xué)活性，其中C5a，C3a，C4a具有過(guò)敏毒素效應(yīng)，C5a具有趨化活

27、性，這些片段在促進(jìn)炎癥反應(yīng)中起重要作用，因而在一些炎癥相關(guān)的疾病中，補(bǔ)體起重要的病理作用，包括自身免疫病、心血管疾病、感染過(guò)程中的炎癥性組織損傷、超急性移植排斥等。通過(guò)抑制補(bǔ)體有可能收到治療疾病的效果,補(bǔ)體測(cè)定的應(yīng)用,診斷病原體感染檢測(cè)補(bǔ)體的功能 CH50檢測(cè)單個(gè)成分的含量及活性 C3、C4、PFB 免疫性疾病相關(guān)疾病時(shí)

28、補(bǔ)體的檢測(cè) 與補(bǔ)體相關(guān)的遺傳性疾病 補(bǔ)體含量顯著降低的疾病 高補(bǔ)體血癥補(bǔ)體參與的試驗(yàn) 溶血空斑實(shí)驗(yàn)、抗C1q抗體檢測(cè)流行病學(xué)調(diào)查補(bǔ)體應(yīng)用于臨床治療后的檢測(cè),,小 結(jié),主要內(nèi)容補(bǔ)體定義活化途徑CH5