體外分析核醫(yī)學(xué)2016全解

1、第六章 體外分析,深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科 申群喜,,,待測(cè)物質(zhì)濃度與檢測(cè)手段,臨床化學(xué)分析,,,,,,,pg/L,ng/L,mg/L,mg/L,g/L,免疫分析,Therapeutic Drugs,Thyroid Hormone,Fertility Hormone,Allergy,Cancer Markers,Infectious Disease,Vitamins,Serum Proteins,,,,,,,,,常量,微量,

2、超微量,,,定 義：,利用放射分析方法或其派生的相關(guān)技術(shù)，測(cè)定生物樣品中微量生物活性物質(zhì)含量檢測(cè)：激素 腫瘤標(biāo)志物 藥物濃度 受體,分 類：,Click to add title in here,4,2,3,體外分析技術(shù),體外放射分析,體外非放射分析,放射性競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析,放射性非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析,放射免疫分析*,(IRMA),免疫放射分析*,酶免疫分析,(EIA),化學(xué)發(fā)光免疫分析,(CLIA),熒光免疫分析,

3、,,,,,,,,,,,(FIA),(RIA),膠體金標(biāo)記分析 (CGIA),第一節(jié) 放射免疫分析 Radioimmunoassay, RIA,Ag,Ab,,,+,Ag-Ab,環(huán) 境 因 素： 離子強(qiáng)度 生理鹽水或緩沖液 酸 堿 度 pH6-pH9, pH7左右 溫 度 15℃-40 ℃ ,37 ℃最適,抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng),

4、一. RIA基本原理*,討論簡(jiǎn)單化，假定的“理想模式”： 抗原和標(biāo)記抗原對(duì)抗體具有完全相同 的免疫活性2. 抗體只有一種抗原結(jié)合位置 1+1=1反應(yīng)3. 反應(yīng)符合質(zhì)量作用定律 Ag+Ab AgAb,一. RIA基本原理*,,,,V1,V2,[AgAb],[Ag] [Ab],K=,一. RIA基本原理*,（一）競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫結(jié)合反應(yīng)：體外條件下 過(guò)量的放射性標(biāo)記抗原（*Ag）與

5、非標(biāo)記抗原（即待測(cè)抗原，Ag）同時(shí)與限量的特異性抗體（Ab）進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫結(jié)合反應(yīng) （三種成份）,Ag-Ab + Ag,*Ag,Ab,,,+,*Ag-Ab,(B),(F),+ *Ag（過(guò)量部分）,*Ag:標(biāo)記抗原 Ag:非標(biāo)記抗原 Ab:特異性抗體*Ag-Ab:標(biāo)記的抗原-抗體復(fù)合物 Ag-Ab:非標(biāo)記的抗原-抗體復(fù)合物,一. RIA基本原理*,一. RIA基本原理*,RIA原理示意圖,,,一. RIA基本

6、原理*,（二） 劑量反應(yīng)曲線/標(biāo)準(zhǔn)曲線： 定量基礎(chǔ)： *Ag-Ab的量（因變量）與Ag的量（自變量）之間存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制數(shù)量關(guān)系函數(shù)關(guān)系：二次函數(shù)關(guān)系 用標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線（簡(jiǎn)稱標(biāo)準(zhǔn)曲線）替代,一. RIA的基本原理*,標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備,一. RIA基本原理*,標(biāo)準(zhǔn)曲線,一. RIA基本原理*,標(biāo)準(zhǔn)曲線(CG),（三）未知樣品的檢測(cè):同等條件下 待測(cè)抗原+過(guò)量的標(biāo)記抗原+限量的特異性抗體 溫育

7、分離B和F 測(cè)量放射性活度 查標(biāo)準(zhǔn)曲線求出濃度,一. RIA基本原理*,一. RIA基本原理*,未知樣品的檢測(cè),,,,[Ag],未知樣品的檢測(cè),一. RIA基本原理*,完整的試劑盒（商品化）包括： 1. 抗體 2. 標(biāo)記抗原 3. 標(biāo)準(zhǔn)抗原 4. 質(zhì)控品 5. 沉淀劑,二. RIA基本試劑,（一）抗體（Antibody,Ab） IgG類 “三高”: 1 親和力 以親和

8、常數(shù)K表示 2 特異性 以交叉反應(yīng)率表示 3 滴度 以抗體最適稀釋度表示,二. RIA基本試劑,,[AgAb],[Ag] [Ab],K=,抗體的制備： 多克隆抗體 免疫動(dòng)物所得抗血清 單克隆抗體 雜交瘤技術(shù)所得抗體,二. RIA基本試劑,（二）標(biāo)記抗原（* Antigen,*Ag）抗原分子中一個(gè)或數(shù)個(gè)原子被放射性核素所取代 標(biāo)記的放射性核素有3H 14C 125I等

9、 125I 比活度高 半衰期合適（60天） 利用酪氨酸的“嗜碘性”標(biāo)記,二. RIA基本試劑,（二）標(biāo)記抗原（* Antigen,*Ag） 要求： 1. 同質(zhì)性 2. 高放射性比活度（kBq/ug) 3. 放射化學(xué)純度 >95% 4. 免疫活性高,二. RIA基本試劑,（三）標(biāo)準(zhǔn)抗原（標(biāo)準(zhǔn)品）高濃度的純品物質(zhì)化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品 結(jié)構(gòu)清楚

10、物理化學(xué)方法可測(cè)定 質(zhì)量單位(ng/L)生物標(biāo)準(zhǔn)品 不能用物理化學(xué)方法測(cè)定 采用與 被測(cè)物質(zhì)相似分子形式的物質(zhì) 生物單位(mIU/L)要求：1. 均質(zhì)性 2. 純度高 3. 定量準(zhǔn)確,二. RIA基本試劑,（四）待測(cè)樣品血漿 血清 體液 組織液要求：符合放射性檢測(cè)方法的要求

11、 去除可能存在的干擾成份,二. RIA基本試劑,（五）檢測(cè)儀器γ計(jì)數(shù)儀：125I 檢測(cè)γ射線閃爍計(jì)數(shù)器：3H或者14C 檢測(cè)β射線,二. RIA基本試劑,（一）理想的分離方法： 1. 完全分離 2. 不影響反應(yīng)的平衡 3. 不受外界或其它試劑的干擾 4. 操作簡(jiǎn)便 重復(fù)性好 5. 來(lái)源方便 價(jià)格低廉,三. RIA分離方法,（二）常用分離方法的比較：分離方法 優(yōu)

12、 點(diǎn) 缺 點(diǎn),三. RIA分離方法,分離快 適用于任何溫育體積 沉淀易于觀察 便宜組分介質(zhì)及損傷組分的分析 新方法的研究和建立分離快，適用于任何溫育體積，蛋白質(zhì)含量較低的分離介質(zhì)蛋白質(zhì)濃度影響小，通用，特異性高，分離完全分離快，簡(jiǎn)易，適用于大批樣品的檢測(cè),條件不易掌握，分離不完全，對(duì)蛋白質(zhì)敏感點(diǎn)樣量少

13、，不能處理大量樣品，測(cè)定體積受限，特殊設(shè)備對(duì)蛋白質(zhì)濃度、離子強(qiáng)度及PH都敏感，沉淀不穩(wěn)定二抗價(jià)格高、流程長(zhǎng)，二次溫育可能建立新的平衡依賴商品供應(yīng)，抗體用量大，價(jià)高，固相抗體貯存不穩(wěn)定,活性炭吸附法電泳法沉淀法雙抗體法固相法,,,,（一）誤差的種類： 1. 系統(tǒng)誤差 確定的原因 :儀器設(shè)備 試劑質(zhì)量 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方式等

14、 結(jié)果：傾向性偏高或偏低 以“準(zhǔn)確度”(accuracy)表示 2. 隨機(jī)誤差 難以確定的原因：放射性測(cè)量的統(tǒng)計(jì) 漲落 探測(cè)儀器不穩(wěn)定等 結(jié)果：雙向性 以“精密度”(percis

15、ion)表示,四. RIA質(zhì)量控制,（二）精密度與準(zhǔn)確度的區(qū)別與聯(lián)系,四. RIA質(zhì)量控制,甲 乙 丙 丁,甲：即準(zhǔn)確又 乙：不準(zhǔn)確， 丙：尚準(zhǔn)確， ?。杭床粶?zhǔn)確 精密

16、 但精密 但不精密 也不精密,1 零標(biāo)準(zhǔn)管結(jié)合率（B0%） 30%-50%2 非特異性結(jié)合率（NSB%）<5%-10%3 室內(nèi)質(zhì)控圖 制作及質(zhì)控規(guī)則,四. RIA質(zhì)量控制,（三）室內(nèi)質(zhì)量控制,（四）室間質(zhì)量控制,第二節(jié) 免疫放射分析 Immunoradiometric assay, IRMA,一.

17、IRMA基本原理*,（一）非競(jìng)爭(zhēng)性免疫結(jié)合反應(yīng)：體外條件下 過(guò)量的放射性標(biāo)記抗體（*Ab）與非標(biāo)記抗原（Ag）進(jìn)行非競(jìng)爭(zhēng)性免疫結(jié)合反應(yīng) （二種試劑 ）,*Ab,+,Ag-*Ab + *Ab,Ag,（B）,（F）,,,（二） 劑量反應(yīng)曲線/標(biāo)準(zhǔn)曲線： 定量基礎(chǔ)： Ag- * Ab的量（因變量）與Ag的量（自變量）之間存在正相關(guān)的函數(shù)關(guān)系 用標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合曲線（簡(jiǎn)稱標(biāo)準(zhǔn)曲線）替代,一. IRM

18、A基本原理*,標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備,一. IRMA基本原理*,IRMA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備,一. IRMA基本原理*,RIA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備,,,B%,,標(biāo)準(zhǔn)曲線,一. IRMA基本原理*,B%,,B%,,,,,IRMA的標(biāo)準(zhǔn)曲線,RIA的標(biāo)準(zhǔn)曲線,一. IRMA基本原理*,二. IRMA常用方法,雙抗夾心法 (double antibody sandwich method)2.標(biāo)記第三抗體法(labeled third antibody m

19、ethod)3.雙標(biāo)記抗體法(double labeled antibody method),優(yōu)點(diǎn)：l   反應(yīng)動(dòng)力學(xué)：非競(jìng)爭(zhēng)性 且抗體過(guò)量 容易達(dá)到平衡 溫度變化對(duì)結(jié)果影響不大。 l   靈敏度：比RIA高出10～100倍。l   加樣誤差少：加樣誤差主要來(lái)自抗原一個(gè)環(huán)節(jié)缺點(diǎn)：l  需要特殊的分離方法。 l 

20、 對(duì)半抗原不適應(yīng)l  要大量的*Ab，昂貴,三. IRMA優(yōu)缺點(diǎn),四. IRMA與RIA主要區(qū)別*,第三節(jié) 非放射免疫分析技術(shù),1 酶標(biāo)記免疫分析技術(shù)2 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù) 3 時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)4 膠體金標(biāo)記分析技術(shù),一 酶標(biāo)記免疫分析技術(shù)（enzyme immumoassay,EIA) 酶分子代替放射性核素 標(biāo)記抗原或抗體的免疫分析的技術(shù) 結(jié)合了抗原抗體高特異性和酶促反應(yīng)的高敏感

21、性。常見(jiàn)方法為ELISA。 常用的酶為辣根過(guò)氧化物酶 底物是四甲基聯(lián)苯胺 (TMB) ，反應(yīng)后顯黃色。,二 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)(CLIA) 以化學(xué)發(fā)光物質(zhì)代替放射性核素作為示蹤物的超微量分析技術(shù)。 1 化學(xué)發(fā)光免疫分析 吖啶酯2 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析 金剛烷3 電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定 三聯(lián)吡啶釕,三 時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)（time-resolved fluoroimmunoassay

22、，TRFIA）,采用稀土元素標(biāo)記抗體，利用時(shí)間分辨熒光儀特定的延遲時(shí)間測(cè)量，獲得稀土元素的特異熒光信號(hào)，同時(shí)消除非特異性熒光物質(zhì)的干擾。,四 膠體金標(biāo)記分析技術(shù)技術(shù)（colloidal-gold immunoassay，CGIA）,采用膠體金為標(biāo)記物，利用氯金酸（HAuCl4)在還原劑的作用下，形成紅色的膠體狀態(tài)。,問(wèn)題：,放射免疫分析反應(yīng)物有幾種 ？放射免疫分析抗原通常用什么標(biāo)記?免疫放射分析反應(yīng)物有幾種？,[小結(jié)],掌握:

23、 1.放射免疫分析的原理 、方法 及質(zhì)量控制 2.免疫放射分析的原理熟悉: 放射免疫分析質(zhì)量控制,思考題：,1. 簡(jiǎn)述放射免疫分析的基本原理及方法。2. 如何利用RIA方法檢測(cè)待測(cè)物？3. 簡(jiǎn)述免疫放射分析的基本原理及方法。4. 放射免疫與免疫放射分析有何區(qū)別？,參考書(shū)：,1.核醫(yī)學(xué)，第七版，李少林等主編，人衛(wèi)出版社;2.核醫(yī)學(xué)，譚天秩主編；3.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)，第五版，