血凝原理 ppt課件

1、血凝檢測原理,儀器檢測原理,凝固法(凝塊形成) 發(fā)色底物法 (吸光度變化) 免疫比濁法 (乳膠粘合),凝固法 PT,APTT,TT,FIB(PT-Based & FIB- Clauss), Factors II, V, VII, X, VIII, IX, XI, XII,Protein C, Protein S, APC-R, LAC,PCX,HPX 發(fā)色底物法 Anti-thr

2、ombin,Heparin(普通&低分子), Plasminogen, Plasmin Inhibitor, 免疫比濁法 D-Dimer, vWF（活性及含量）, Free Protein S，VIII含量，HS-CRP 正在研發(fā)的實驗項目：······,儀器檢測項目,Photo-optic method:IL instru

3、mentation,From ACL 100 ACL Futura ACL Topto ACL 10000 ACL Advanceto ACL Elite 凝固法 660 880 671 散射比濁 透射比濁 透射比濁發(fā)色底物法 405 405

4、 405 吸光率 吸光率 吸光率乳膠 凝集試驗 405 405 405 or 671 Electra = 550 for clotting and 405 for chromogenic,,,,,,,測量濁度的變化它并不是一種由于顏色變化引起的吸

5、收值的變化（區(qū)別于發(fā)色底物法)為了避免干擾（膽紅素，血紅蛋白），通常選擇高波長進行檢測,凝固反應,光學檢測法,,,膽紅素,血紅蛋白,乳糜,膽紅素，血紅蛋白和乳糜在檢測時吸收峰位置,波長,ACL,Other,Other,凝固法檢測史,手工法檢測,反應在試管內發(fā)生(37° C水)凝塊形成，操作人員肉眼可見操作人員記錄時間,手工法檢測,血凝常規(guī)檢測,血漿或稀釋血漿 (37°C孵育) + 試劑 (預加熱 37&#

6、176;C)->纖維凝塊形成->纖維凝塊形成所需時間,所有的凝固反應均為纖維凝塊形成過程的檢測如: PT, APTT, Fibrinogen Clauss, 因子檢測, 等,纖維蛋白凝塊檢測,持續(xù)檢測光密度變化 (透射法或散射法）凝固時間由數(shù)學運算法則決定 (域值, 第一演算法,第二演算法等),光學法檢測,最經典的運算法則:閾值，正好能產生特定效應的界限（反應濁度的變化) 第一法則 (反應速度)

7、 第二法則 (反應加速度),儀器的運算法則決定反應時間,運算法則: 閾值法,,,,,,,,,,,Time,,,凝固點,,濁度或光散射值,閾值法（凝固起始點）,濁度閾值法用于 (曲線delta的絕對值或百分比)允許識別凝固點,,應用于下列情況:Example: 纖維蛋白原Clauss; delta信號弱, 當FIB濃度高時，曲線上升快，而濃度低時曲線上升緩慢。在某些標本中逆向檢測的閾值用于曲線的末端是非常平坦的。,閾值法,運算法則

8、: 閾值法,,,,,,,,,,,Time,,凝固點,一階導數(shù)法,,,,,,,,,,It is established that the maximum speed of the reaction represents the clot point,,濁度或光散射值,運算法則: 一階導數(shù)法,一階導數(shù)的真實表現(xiàn),運算法則: 一階導數(shù)法,用于以下情況:基線不總是平坦的 通常情況下，反應速度快凝固曲線信號清晰，纖維蛋白形成過程中沒有起

9、伏凝固的時間較長 (與閾值法或二階導數(shù)法比較),一階導數(shù),運算法則: 一階導數(shù)法,應用于以下情況:Example: Recombiplastin; 凝固曲線上升很快, 凝固曲線的形狀清晰, 凝固時間較長 (與閾值法或二階導數(shù)法比較)一階導數(shù)的曲線總是正的 (or zero),一階導數(shù),運算法則: 一階導數(shù)法,,,,,,,,,,,Time,,凝固點,二階導數(shù),,,,,,,,,,,,,,,,反應的最大加速度點,,運算法則: 二階導

10、數(shù)法,濁度或光散射值,二階導數(shù)法的真實表現(xiàn),運算法則：二階導數(shù)法,用于以下情況:基線不總是平坦的通常情況下反應加速度快凝固曲線信號清晰，在基線和凝塊形成期無起伏該運算法則主要應用于凝固反應試驗(i.e. APTT type),二階導數(shù)法,運算法則: 二階導數(shù)法,通常應用于下述情況:Example: APTT; 凝固曲線相對清晰，反應加速度快， 曲線外觀沒有大的起伏。二階導數(shù)曲線可正可負。,二階導數(shù),運算法則: 二階導

11、數(shù),實際上，大部分凝固反應運算使用的是二階導數(shù)。少許情況下使用一階導數(shù)。其它一些反應使用閾值法更合適。不同的運算法則由不同的試驗所選擇。,一種完善的算法是否存在 ?,凝固曲線,發(fā)色底物法,發(fā)色底物試驗的基本反應是：未稀釋血漿或稀釋后血漿(incubated at 37°C) + 試劑 (酶)->中間復合物+ 試劑(底物)剩余的酶能水解特殊的底物， 去除pNA 分子，產生顏色反應。,發(fā)

12、色底物試驗,發(fā)色底物法(如：抗凝血酶試驗),,,AT + Heparin,,[AT*Heparin],[AT*Heparin] + FXa (excess),,[AT-FXa- Heparin] + FXa (residual),Chromogenic substrate,FXa (residual),,Peptide + pNA,標本與肝素（外源性）一同孵育。過量的FXa 加入。過量的FXa水解加入的底物。pNA產生。,Chro

13、mogenic Method,pNA呈黃色，隨后被分光光度計測量 (at 405 nm).測量值與定標曲線比較得出濃度值。,發(fā)色底物法,Antithrombin:Neat plasma 100%, diluted at 50 % and 25%,發(fā)色底物法,AT Linearity,免疫比濁法，Ｄ－二聚體檢測,免疫學方法,D-Dimer Curve,典型的曲線像一個大的S有一個初始的基線，一個上升階段和一個終點 (平臺期)

14、,反應曲線,反應曲線,,,,,,,,,,時間,,,,,,,初期; 凝血因子激活期,纖維蛋白原正在轉化為纖維蛋白,平臺期; 所有的纖維蛋白原均已轉化為纖維蛋白,吸光度變化,凝固曲線和反應曲線是一個良好的工具 。,這種工具為確?？煽康慕Y果提供保障，既節(jié)省時間，又節(jié)省費用。,?,結論：,a,b,g,纖維蛋白的形成過程,Fibrinogen is composed of 3 chains,the formula is: 2(a,b,g),纖維蛋

15、白的形成過程,纖維蛋白原轉變?yōu)槔w維蛋白通過三個步驟,1. 蛋白水解(通過凝血酶),凝血酶水解纖維蛋白肽,纖維蛋白單體,纖維蛋白的形成過程,2. 纖維蛋白單體自發(fā)聚合,纖維蛋白的形成過程,2. 纖維蛋白單體自發(fā)聚合,纖維蛋白的形成過程,2. 纖維蛋白單體自發(fā)聚合,纖維蛋白的形成過程,Fibrin fibre,2. 纖維蛋白單體自發(fā)聚合,纖維蛋白的形成過程,2. 纖維蛋白形成纖維蛋白網,Fibrin net,,,,,,,,,,,,,,纖維蛋

16、白的形成過程,3.通過鉸鏈形成穩(wěn)定的纖維蛋白,XIII,Thrombin,纖維蛋白的形成過程,XIII,Thrombin,3.通過鉸鏈形成穩(wěn)定的纖維蛋白,纖維蛋白的形成過程,XIIIa,Thrombin activates FXIII,3.通過鉸鏈形成穩(wěn)定的纖維蛋白,纖維蛋白的形成過程,XIIIa,3.通過鉸鏈形成穩(wěn)定的纖維蛋白,纖維蛋白的形成過程,XIIIa,3.通過鉸鏈形成穩(wěn)定的纖維蛋白,XIIIa,FXIIIa stabilise

17、s fibrin by introducing covalent bonds,3.通過鉸鏈形成穩(wěn)定的纖維蛋白,纖維蛋白的形成過程,PT衍生纖維蛋白原（PT based FIB ）Clauss法纖維蛋白原（Clauss FIB）,ACL系列凝血儀纖維蛋白原檢測,FIB的檢測方法,PT based FIB的基本原理基于PT反應曲線光學差值與FIB濃度的線性關系,,,,濃度,FIB的檢測方法,Clauss法FIB的基本原理,首選Claus

18、s方法—NCCLS推薦如考慮測試成本，可選用PT based FIB做常規(guī)篩查，超出200-400mg/dL范圍樣品及OAT病人樣品用Clauss法復查,FIB方法使用建議,Clause 方法與PT 衍生法結果比較口服抗凝藥病人,標本: 411 正常人, 50 位口服抗凝藥病人方法: Clauss 和PT 衍生法結果: Clauss PT derived