第六節(jié) 臨床生物化學實驗方法的選擇與評價

1、臨床生化方法的建立選擇與評價,,教學內容與教學要求,專業(yè)技術基本知識常用玻璃儀器常用基本儀器設備常用試劑及純水臨床生化檢驗樣品臨床生化檢驗實驗方法臨床生化檢驗質量控制實驗數據的有效使用行政管理基本知識,實驗用純水,天然水含有許多雜質點,懸浮物泥沙、藻類、植物遺體等膠體物質粘土膠粒、溶膠等溶解物質Na+/K+/Cl+/Ca++HCO3-/NH3有機物微生物,天然水的處理,天然水↓簡單的物理、化學方法處理

2、，↓除去懸浮物和部分無機鹽。自來水↓蒸餾、電滲析等處理，除去雜質。實驗用純水,純水的制備方法,蒸餾法：經典方法。理論上為“純水”，但難除去揮發(fā)性物質和微滴。離子交換法：除去水中的陰、陽離子雜質。電滲透析法：除去水中的陰、陽離子雜質。炭吸附法：除去水中的有機物。超濾膜法：除去水中的懸浮物?；旌霞兯到y(tǒng),純水的純度檢查指標,電導率或電阻率用電導儀或歐姆表測定；電導單位為西門子（S），電導是電阻的倒數；1S=1Ω-1

3、每cm長的電導為電導率（S.CM-1）可溶性硅檢驗細菌菌落計數,美國NCCLS等級純水的規(guī)定,級別 Ⅰ級 Ⅱ級 Ⅲ級微生物含量（最大菌落/ml） 10 103 未定pH 未定 未定 5.0-8.0

4、電阻率 （ MΩ/cm,25℃ ） 10 2.0 1.0硅（mgSiO2,最大量） 0.05 0.1 1.0 微粒 （μm微孔膜濾過） 0.2 未定 未定有機物 活性炭過濾 未定 未定,,,,美國臨床實驗室標準化委

5、員會(National Committee for Clinical Laboratory Standards, NCCLS),NCCLS、CAP規(guī)定的等級純水用途,級別 用途NCCLS Ⅰ 原子吸收、火焰光度、電解質、熒光、酶、 高靈敏度層析、電泳、參比液、緩沖液 Ⅱ 一般實驗檢驗

6、、玻璃器皿沖洗 Ⅲ 玻璃器皿洗滌、要求不高的定性試驗 CAP Ⅰ 原子吸收、火焰光度、電解質、血氣、酶、 無機元素、參比液、緩沖液 Ⅱ 一般實驗檢驗、血液學、血清學、微生物學 Ⅲ 普通定性、尿液檢驗、組織切片、寄生蟲、

7、 器皿洗滌,,,,美國病理醫(yī)師學會 (College of American Pathologists, CAP),影響實驗用純水質量的環(huán)節(jié),制備貯存運輸使用所有環(huán)節(jié)均應避免污染。,臨床生物化學實驗方法的選擇建立與評價,教學內容與教學安排,實驗方法選擇與評價的流程實驗方法的選擇實驗方法的建立實驗方法的評價,實驗方法選擇與評價的流程,↑→→→ 方法選擇 ↑ ↓↑ ↑

8、 方法評價←←←方法發(fā)展 ↑ ↓ ↑ ↑ 常規(guī)分析前的準備←預防措施 ↑ ↓ ↑ ↑ 常規(guī)分析后的補充←預防措施 ↑ ↓ ↑

9、 診斷性能←←常規(guī)分析→→→統(tǒng)計質控→結果報告,臨床生化實驗方法的選擇,教學內容與教學要求,實驗方法選擇的目的實驗方法的分級標準品的分級實驗方法選擇的原則實驗方法選擇步驟,實驗方法選擇的目的,結合自身的條件，確定合適的、某項目的檢測方法；保證擬使用的方法在正式使用前，已了解方法分析性能及可能引入的誤差。,實驗方法的分級,決定性方法（definitive method)：準確度最高，系統(tǒng)誤差最小，用于評價參考方法和一級標準品

10、。參考方法（reference method）：準確度與精密度已充分證實的分析方法，干擾，系統(tǒng)誤差小，用于鑒定常規(guī)方法和二級標準品。常規(guī)方法（routine method）：性能指標符合臨床需要，有適當分析范圍，經濟實用，用于臨床常規(guī)標本的檢測。,三級實驗方法的關系圖,臨床生化部分項目的三級方法,決定性方法 參考方法 常規(guī)方法鉀 ID-MS 火焰光度法 離子選擇電極鈉

11、 中子活化法 火焰光度法 離子選擇電極總蛋白 —— 凱氏定氮法 雙縮脲法肌酐 ID-MS 離子交換層析 苦味酸比色法葡萄糖 ID-MS 己糖激酶法 G氧化酶法AST —— MD-NADH法 賴氏法ALT —— LD-NADH法 賴氏法,,,,同位素稀釋-質譜

12、法（isotope dilution – mass spectrograph, ID-MS）,用什么來評價和校正以上方法,方法是干什么的？標準物質,標準試劑,又稱標準品，參考物（reference material）它是一種或幾種物理或化學性質已經充分確定，可用以校正儀器和某種測定方法的物質。用途是進行方法學評價、儀器校正、常規(guī)分析的質量控制等不可缺少的物質。,標準試劑的分級,一級標準品（原級參考物）：由決定性方法或高度準確的

13、若干方法定值。雜質含量確定，有證書；用于校正決定性方法，評價及校正參考方法，為二級標準品定值。二級標準品（次級參考物） ：由實驗室自配或商品，以參考方法用一級標準品定值。用于常規(guī)方法的標化或控制物定值。控制物：以參考方法用一級或二級標準品定值，用于常規(guī)質量控制，不用于標定儀器或方法。,各級分析方法和標準品的關系,決定性方法 一級標準品參考方法

14、 二級標準品常規(guī)方法 控制物,選擇什么樣的方法好？,最好？較好？好？一般？差？,實驗方法選擇的原則,一切從實際出發(fā)，確定適當的方法。選擇常規(guī)方法時，盡量選擇國內外通用方法或推薦方法。重點考慮的性能指標：實用性：微量快速、方法簡便、安全可靠、經濟實惠?？煽啃裕壕苄詼蚀_度高，靈敏度高，線性好，干擾少。CV<5%，CB<

15、5%。,CV：變異系數，代表不精密度； CB：偏差系數，代表不準確度,實驗方法選擇的步驟,廣泛查閱文獻：對各種方法進行優(yōu)、缺點比較論證。選定候選方法：符合實用性、可靠性要求。進行初步試驗：精密度、準確性、線性范圍、儀器與試劑要求、操作難易等進行試驗。,臨床生化方法的建立,臨床生化方法的建立,方法原理確定：根據不同類型的方法有不同的原理光譜法、層析法、電泳法、酶法等實驗條件選擇：合適的吸收光譜、pH、雜質干擾、反應的溫

16、度和時間、 穩(wěn)定性試驗。,臨床生化實驗方法學的評價,教學內容與教學要求,實驗方法學評價目的評價的基本內容實驗誤差評價的基本步驟方法評價指標評價實驗方法性能判斷,實驗方法學評價目的,通過對實驗誤差的測定，決定侯選方法是否可以被接受。,方法評價的基本內容,通過實驗途徑，測定并評價方法的準確度和精密性。不論精密度還是準確度強調的都是對誤差的測定。,方法評價的基本步驟,評價前階段評價前實驗：最適條件的研究評價階段初步評

17、價：批內重復、干擾、回收試驗最后評價：批間重復、比較方法對比、總體判斷評價后階段評價后實驗：臨床相關研究方法應用：建立質控系統(tǒng)，引入常規(guī)工作等。,實驗誤差,實驗誤差的類型系統(tǒng)誤差（systematic error,SE）隨機誤差（random error,RE）實驗誤差的表示方法平均誤差標準偏差絕對或相對誤差和偏差變異系數,方法評價指標,精密度（precision）準確度（accuracy）特異度（specif

18、icity）干擾（interference）檢測能力（detection limit）,評價實驗,重復性試驗回收試驗干擾試驗方法對比試驗,分析誤差類型與評價實驗的關系,重復性試驗（1）,目的：考察候選方法的隨機（偶然）誤差。衡量精密度。方法：對同一材料分成數份試驗樣品進行多次（n=20）測定，計算X、S、CV。,,重復性試驗（2）,形式：批內重復性試驗，天內重復性試驗，天間重復性試驗，病人標本的平行雙份測定。注意問題

19、：分析樣品的選擇：標準液、質控液、病人標本均可。分析物濃度的選擇：醫(yī)學決定水平,回收試驗（1）,目的：測定候選方法的比例系統(tǒng)誤差，衡量準確度。方法：將被測標準液加入常規(guī)分析物（病人標本）中，成為分析標本，測定計算回收率?；厥章?回收濃度/加入濃度×100%，理想回收率100%，一般要求為95%—105%,回收試驗（2）,注意事項：吸量準確；加入標準液后，其實驗樣品的被子測濃度最好達到醫(yī)學決定水平；總濃度必須

20、在方法分析范圍內；需加入高中低不同濃度回收試驗，計算平均回收率；加入標準液的體積一般在10%內；重復2-3次。,干擾試驗（1）,目的評價候選方法準確度，發(fā)現恒定系統(tǒng)誤差。方法：與回收試驗相似，但加入的是干擾物質。干擾值＝分析標本測得值－基礎標本測得值,干擾試驗（2）,注意事項被試驗的物質：膽紅素、溶血、防腐劑、抗凝劑、藥物等可疑干擾物的濃度：干擾物濃度有可能達到病理標本最高濃度值。消除干擾常用方法空白對照，物理、

21、化學方法分離干擾物雙波長微量樣本（標本與試劑比例加大）,對比試驗（1）,目的用于評價候選方法的系統(tǒng)分析誤差分析誤差的性質，包括比例和恒定兩種系統(tǒng)誤差。方法：對同一組病人標本用候選方法和對比方法同時進行分析測定；分析二者差異。,對比試驗（2）,注意事項：比較方法的選擇：最好為參考方法標本數：一般為40—100，分析物濃度：最好包括各種情況重復分析：最好分批測定2次時間間隔：每天2-5個標本，20天圖示結果統(tǒng)計處

22、理,方法學評價實驗小結,重復性試驗：測定候選方法的偶然誤差，衡量精密度。回收試驗：測定比例系統(tǒng)誤差，衡量準確度。干擾試驗：測定恒定系統(tǒng)誤差，衡量準確度。方法對比試驗：檢測候選方法的系統(tǒng)分析誤差。,方法學性能判斷原則,候選方法接受與否，根據實驗誤差結果進行歸納，作出判斷。依據Westgard制定的“可允許誤差的95%限度”，計算各項誤差與其比較，任何一項大于可允許誤差（標準限）都不能被接受。,方法學性能標準,性能標準（

23、Performance Standards，PS)，也稱分析目標，由允許分析誤差和醫(yī)學決定水平這兩項內容決定。允許分析誤差（ EA ）： 表示95%的樣本允許誤差限度。醫(yī)學決定水平（Xc）：具有臨床意義的分析物濃度。EA 和Xc兩項是一個測定方法的性能指標。,文獻報道的性能指標,測定項目 醫(yī)學決定水平 允許誤差鉀 3.0mmol/ L 0.5

24、 6.0mmol/ L 0.5鈣 11mg/dL 0.5葡萄糖 11mg/dL 10.0 100mg/dL 10.0 120mg/dL 10.0總蛋白 7.0g/dL

25、 0.6,,,,方法學性能標準制定原則,制定性能標準，要反映臨床應用與解釋結果的要求（醫(yī)學效用限度），又要基本符合實驗室所能做到的技能狀態(tài)。,目前常用的性能判斷指標,單值判斷指標可信區(qū)間判斷指標較復雜，客觀，起最后判斷作用,單值判斷指標,誤差類別 判斷指標 備注隨機誤差（RE） 1.96STM<EA STM=重復試驗的

26、 標準差比例誤差（PE）(|R-100|)(XC/100)<EA R=平均回收率恒定誤差(CE) |偏差|<EA 由干擾試驗測出系統(tǒng)誤差(SE) |(a+bXc)-Xc|<EA 對比試驗回歸方程總誤差

27、(TE) RE+SE<EA 包括偶然及系統(tǒng)誤差結果判斷:試驗樣品較小,其分析誤差可靠性差,只有假設實驗結果正確的前提下才能按上表計算,,,,可信區(qū)間判斷指標,誤差類別 實驗 接受指標EUEA隨機誤差 重復性 1.96STMUEA比例誤差 回收 |RU或L-100|U (XC /100)EA*恒定誤差 干擾

28、|d|+t(sd)/√NUEA** 系統(tǒng)誤差 對比 | (a+bXc±W)-XC| UEA***總誤差 重復 √(1.96STMU)2+W2 √(1.96STML)2+W2 對比 +|a+bXc)-XC|EA# *特例:當RU>100>RL,PEL=0 **特例:當t(sd)/√NL>

29、/偏差/,CEL=0 ***特例:當(a+bXc+W)>XC >(a+bXc-W),CEL=0 # 特例:當SEL=0,TEL=REL,,,,,評價實驗書面報告,內容原理、試劑配制、所用器材、操作步驟等結論可接受或不被接受后期工作評價后實驗和應用階段。,常規(guī)分析前的準備,教學內容與教學要求,制定參考值臨床病例觀察質量控制觀察,制定參考值,參考個體（預定標準個體）

30、 ↓ 參考人群 ↓ 參考標本 ↓

31、 參考值（X） 將病人 ↓ 標本 參考分布（正態(tài)或偏態(tài)） 的結果 ↓ 與之 參考限（計算S）

32、 對照 ↓ 參考區(qū)間（X±2S）,臨床病例觀察（1）,常規(guī)標本的測定特殊標本的測定高低值溶血藥物干擾,臨床病例觀察（2）,觀察指標診斷特異性、靈敏度和準確度與疾病發(fā)生概率有關預示值一項診斷試驗確定或排除某些疾病存在與否的診斷概率。表示診斷與排除把握程度多少,質量控制

33、觀察,質控物與日常工作測定，連續(xù)測定一個月。觀察常規(guī)實驗中的準確性和精密性。,診斷試驗的診斷性能評價,診斷性能評價與技術性能評估,采樣 檢測 機體—————標本—————信息（狀態(tài)） （指標） （數據） ↑————判斷、推斷————↓指標能否反映狀態(tài)？ 數據是否真實？診斷準確性？ 檢測準確性？疾病

34、 樣本臨床試驗 實驗室實驗流行病學調查 統(tǒng)計學分析,檢驗診斷性能評價兩個層次,,,非量化的臨床意義解釋（判斷疾病及程度）內容：參考值（健康狀態(tài)——健康或疾病） 醫(yī)學決定水平（狀態(tài)與要求——程度與措施）基礎：病理生理、生化知識等醫(yī)學知識量化的診斷性能評估（判斷的可信度）內容：診斷靈敏度、診斷特異性、診斷正確率 陽

35、性預示值、陰性預示值、實驗有效率 陽性似然比、陰性似然比基礎：遵循EBM原則的臨床隨機對照試驗,檢驗項目臨床意義的解釋,（判斷有無疾病以及疾病的程度）,參考值,1969年，Grasbeck首先提出，經IFCC認可，“參考值”與“參考范圍”概念：規(guī)定人群中抽樣進行測定，由此得到的均數及分布范圍，作為代表人群的判斷參考參考個體指選擇用于決定界點的個體，參考總體指所有參加抽樣的參考個體，參考值指反映總體的觀察值，參考值分布指

36、參考樣本觀察值的分布，參考限指參考分布值上、下限,國際臨床化學聯合會(International Federation of Clinical Chemistry, IFCC),參考值確定,確定參考值：將參考總體的結果，經統(tǒng)計學處理求出X和S，通常參考值定為X±2S，非正態(tài)分布用百分位數表示參考值應著重考慮樣本代表性和可用性,正常人與病人的分布曲線圖,建立、引用參考值注意事項,正確選擇受檢對象，以受檢對象的確對所反映的總體具

37、有代表性為原則；合理規(guī)定參考人群的條件，如年齡、性別、民族，以及標本采集的時間和地區(qū)因素等；保證一定數量的受檢人數，一般應有100例以上，若指標分布呈偏態(tài)時應在120例以上，特殊情況至少也應30例以上；測定方法標準化，保證結果的可靠性和可比性。根據專業(yè)知識確定單、雙側位界，嚴格按照統(tǒng)計要求進行測定結果的處理。,醫(yī)學決定水平,醫(yī)學決定水平指臨床按照不同病情給予不同處理的指標閾值一個診斷試驗一般確定三個決定水平： 提示需

38、要進一步檢查的閾值 提示需要治療措施的界點 提出預后或要緊急處理的界值,醫(yī)學決定水平實例分析,血清cTnI濃度 0.1μg/L 0.8μg/L 正常 可疑 AMI,診斷試驗診斷價值評估,評估指標與患病情況的關系,,,,,診斷試驗準確性,準確性（accuracy，AC）又稱真實性（validity）

39、 ，是診斷試驗測量值與實際值的符合程度，即判斷受試者有病與無病的能力。常見指標靈敏度、特異性；漏診率、誤診率一致性：診斷準確度、Kappa指數,靈敏度,靈敏度（sensitivity, Sen）又稱敏感性、真陽性率（True positive rate，TPR），指在患病者中，應用該診斷試驗檢查得到陽性結果的百分比。靈敏度反映診斷試驗正確地識別患病者的能力, 該值愈大愈好。 真陽性靈敏

40、度＝------------------×100% 真陽性＋假陰性,特異度,特異度(specificity, Spe)又稱特異性、真陰性率（True negative rate，TNR），指在非某病者中，應用該試驗獲得陰性結果的百分比。特異度反映診斷試驗正確地鑒別非患者的能力，該值愈大愈好。 真陰性特異度＝---------------------×

41、;100% 假陽性＋真陰性,漏診率和誤診率,漏診率（β），又稱假陰性率（False negative rate，FNR）。反映將患者診斷錯誤的概率，該值愈小愈好。與靈敏度互補的指標,漏診率（β）＝1－Sen誤診率（α），又稱假陽性率（False positive rate，FPR）。反映將非患者診斷錯誤的概率，該值愈小愈好。與特異度互補的指標,誤診率（α）＝1－Spe,預測值,預測值（predi

42、ctive value, PV）也稱預告值或診斷價值，包括陽性預測值和陰性預測值，分別表示診斷試驗結果確定或排除某種疾病存在與否的診斷概率。預測值受流行率的影響。,陽性預測值,陽性預測值(positive predictive value，PPV或＋PV)表示在診斷試驗結果為陽性的人數中，真正患病者所占的百分率，即試驗結果陽性者屬于真病例的概率。也叫患病的試驗后可能性。

43、真陽性陽性預測值＝--------------------×100% 真陽性＋假陽性,陰性預測值,陰性預測值(negative predictive value，NPV或－PV)表示在診斷試驗結果為陰性的人中，非患病者所占的百分率，即試驗結果陰性者屬于非病例的概率。也叫非患病的試驗后可能性。 真陰性陰性預測值＝---

44、-----------------×100% 真陰性＋假陰性,診斷試驗的選擇原則,臨床靈敏度指診斷試驗檢出陽性病人的百分率（TP率）臨床特異性指診斷試驗檢出陰性百分率（TN率）選擇原則靈敏度高，漏診率低，誤診率高；特異性高，漏診率高，誤診率低臨床多采用靈敏度與特異性相結合的方法,受試者工作特征曲線,ROC曲線的概念,受試者工作特征曲線（receiver operator

45、 characteristic curve, ROC曲線），是根據一系列不同的二分類方式（分界值或決定閾），以真陽性率（靈敏度）為縱坐標，假陽性率（1-特異度）為橫坐標繪制的曲線。,ROC曲線的主要作用,ROC曲線能很容易地查出任意界限值時的對疾病的識別能力。選擇最佳的診斷界限值。兩種或兩種以上不同診斷試驗對疾病識別能力的比較。,受試工作曲線（ROC）,不同分界值的陽性率、陰性率和假陽性率（CK為例）

46、 分界值/血清CK水平（U/L）百分率（%） ≥280 ≥80 ≥40 ≥1 TP 42 93 99 100 TN 99 88 68 0 FP

47、 1 12 32 100 將上表數據，以TP率對FP率作圖，并將對于每對TP率和FP率的點（代表不同分界值）連接起來就得一條ROC曲線,,,,陰性率,假陽性率,ROC曲線,ROC曲線值得注意的性質,如圖左上角代表一個完美的診斷試驗TP=1.00,FP=0.00,最靠近左上角的ROC曲線上的點是犯錯最少的最好分界值,在這點,假陽性和假陰性最低ROC曲線除了選擇適