realtimepcr原理和應(yīng)用報告(.ppt)-生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所

1、,實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用 (Real time Quantitative PCR) 分子生物學(xué)技術(shù)平臺 江燕瓊,提綱：􀂇,實(shí)時熒光定量PCR原理􀂇 數(shù)學(xué)原理 化學(xué)原理實(shí)時

2、熒光定量PCR的方法應(yīng)用 絕對定量 相對定量定量PCR的實(shí)驗(yàn)要素平臺定量PCR儀器介紹,實(shí)時熒光定量PCR定義：,在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實(shí)現(xiàn)了實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，對起始模板進(jìn)行定量分析的方法。,與普通PCR的區(qū)別,普通PCR技術(shù)： 在PCR結(jié)束后對終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。實(shí)時定量PCR技術(shù)：實(shí)時檢測PCR擴(kuò)增，在擴(kuò)增的指數(shù)期對起始模板進(jìn)行定量。,熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)

3、定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，一般熒光域值的設(shè)置是 基線（背景）熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為 CT 值（ threshold value ）。,,定量PCR的數(shù)學(xué)原理,,,斜率與擴(kuò)增效率,,熒光定量PCR化學(xué)原理,非特異性熒光標(biāo)記： 1、SYBR Green 特異性熒光標(biāo)記： 2、TaqMan,1、SYBR Green 法,,

4、SYBR Green 熔解曲線分析,,SYBR Green法優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn):對DNA模板沒有選擇性適用于任何DNA􀂉使用方便--不必設(shè)計復(fù)雜探針􀂉非常靈敏􀂉便宜,2、TaqMan探針法,,TaqMan作用機(jī)理,,TaqMan法優(yōu)缺點(diǎn),Real-time PCR 方法應(yīng)用,?絕對定量(Absolute Quantification，AQ) 病原體檢測 轉(zhuǎn)基因

5、食品檢測 基因表達(dá)研究?相對定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同組織中的表達(dá)差異 藥物療效考核 耐藥性研究,絕對定量與相對定量的定義,絕對定量通過標(biāo)準(zhǔn)品定量,絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品： 已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA，做系列稀釋。標(biāo)準(zhǔn)樣品的種類：?含有和待測樣品相同擴(kuò)增片段的克隆質(zhì)粒?含有和待測樣品相同擴(kuò)增片段的cDNA?PCR的產(chǎn)物,絕對定量：從熒光到拷貝

6、數(shù),,相對定量通過內(nèi)標(biāo)定量,內(nèi)標(biāo)（Endogenous Control）通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響小內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組數(shù)量,相對定量：參照因子Calibrator,,相對定量分析方法1 -ΔΔCt,前提：目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴(kuò)增效率接近100％且偏 差在 5％以內(nèi) 1、用內(nèi)參基因的CT值歸一目標(biāo)基因的CT值：

7、 ΔCT（test)= CT （target,test) - CT （ref,test) ΔCT（calibrator)= CT （target, calibrator) - CT （ref, calibrator) 2、用校準(zhǔn)樣本的ΔCT值歸一試驗(yàn)樣本的ΔCT值： ΔΔCT= ΔCT（test) - ΔCT（calibrator) 3、計算表達(dá)水平比率：

8、 2 –ΔΔCT=表達(dá)量的比值,相對定量分析方法2：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法目標(biāo)基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率不同,待測樣品目的基因濃度 待測樣品內(nèi)參基因濃度 F=

9、 對照樣品目的基因濃度 對照樣品內(nèi)參基因濃度,,,,,定量PCR的實(shí)驗(yàn)要素,樣品,●DNA純度：OD260/OD280=1.8，1.6 ~ 2.0之間●DNA用量：0.05 ng –100 ng●RNA純度：OD260/OD280=2.0 ●cDNA用量：1-100 ng 總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA取1 uL,標(biāo)準(zhǔn)品,,標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋方法,,復(fù)管測試

10、●樣品和標(biāo)準(zhǔn)品都要重復(fù)●重復(fù)次數(shù)須遵循統(tǒng)計學(xué)要求,平臺PCR儀介紹,ABI 7500 fast,特征：使用96孔板，樣品量大，儀器穩(wěn)定，結(jié)果分析直觀ABI試劑ROX校正物理方面的誤差：槍的誤差（如試劑體積）、耗材質(zhì)量（如管蓋厚度、透光性能不一致）所導(dǎo)致的光能損失、儀器穩(wěn)定性（如孔間、批間溫度的波動）Rn= Normalization = Reporter / Referenc,Rotor gene 6500HRM,特征：