奶牛乳腺炎的病原菌分離鑒定、毒力基因檢測與基因治療研究.pdf

1、乳腺炎一直是危害奶牛業(yè)的重要疾病，但隨著抗生素的長期和盲目使用，其防治難度越來越大。為了深入調查奶牛乳腺炎的病原，該研究從江蘇省5個牛場采集了100份臨床顯性和隱性乳腺炎奶樣，并進行了細菌分離與生化鑒定。結果顯示在乳腺炎患牛奶樣中，大腸桿菌的分離率最高(82％)，其次是乳房鏈球菌(53％)、金黃色葡萄球菌(41％)、停乳鏈球菌(29％)和無乳鏈球菌(27％)。在臨床顯性乳房炎中，乳房鏈球菌和金黃色葡萄球菌的混合感染普遍，而且以前認為無致

2、病性的表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌也占一定比例(分別為15％和10％)。選用16種針對革蘭氏陽性菌的抗生素，對30株乳房鏈球菌、20株無乳鏈球菌、10株停乳鏈球菌和40株金黃色葡萄球菌進行了藥物敏感性實驗，結果顯示大多數鏈球菌菌株對米諾環(huán)素、環(huán)丙沙星高度敏感，對臨床常用的復方新諾明、苯唑青霉素等具有較高的耐藥性；大多數金黃色葡萄球菌對萬古霉素和壯觀霉素高度敏感，對臨床常用的呋喃妥因、氯霉素、米諾環(huán)素等具有較高的耐藥性。
　　 為了

3、研究致奶牛乳腺炎大腸桿菌的毒素基因、毒力島基因、粘附素基因、溶血素基因、外膜蛋白基因等分子流行病學，對分離自江蘇5個奶牛場的123株致奶牛乳房炎大腸桿菌進行了相關毒力因子的PCR檢測。結果顯示從76株(61.8％)致奶牛乳房炎大腸桿菌中檢測到毒素基因(LT1、ST1、ST2、Cnf1、Cnf2)，其中LT1+占17.1％，ST2+24.4％，Cnf2+占20.3％，未檢測到ST1、Cnf1毒素基因；從68株(55.3％)致奶牛乳房炎大腸

4、桿菌中檢測到毒力島相關基因(irp2、Ecs3703、aer)，ETT2毒力島的檢出率最高(36.6％)，其次為HPI(14.6％)，檢測率最低的為攝鐵相關基因(4.1％)；從8株(6.5％)致奶牛乳房炎大腸桿菌中檢測到粘附素相關基因(clpG、pap、sfa、afaD8、afaE8、F17b、F17a)，其中2株(1.6％)為F17a+，3株(2.4％)攜帶P菌毛，3株(2.4％)攜帶S菌毛，未檢測到攜帶非菌毛粘附素、CS31A粘附素

5、和F17b基因；在123株致奶牛乳房炎大腸桿菌中，8株(6.5％)產生溶血素，21株(17.1％)產生血清抗性因子。
　　 為了便于防治奶牛乳腺炎基因藥物的推廣應用，在前期試驗基礎上，用無針頭注射器將表達人溶菌酶的重組質粒在干乳期注射健康奶牛乳腺或泌乳期乳腺炎患牛乳腺，根據乳汁的CMT檢測結果判定防治效果。結果顯示每乳區(qū)兩次注射500微克重組質粒，對乳腺炎的預防效果在90％以上，對泌乳期隱性乳腺炎的治療效果為81.8％，與乳腺基

6、部穿刺法的防治效果相當，說明無針注射法能取代常規(guī)有針注射法用于奶牛乳腺炎的防治，具有無需保定、無交叉污染和效率高等優(yōu)點。
　　 為了進一步評價基因藥物治療奶牛乳腺炎的安全性，將15頭患隱性乳腺炎的奶牛隨機均分為3組，分別以400μg/乳區(qū)、600μg/乳區(qū)、800μg/乳區(qū)的劑量，通過乳房基部穿刺注射表達人溶菌酶基因的重組質粒p215C3LYZ，24 h后重復注射一次，觀察奶牛的精神、食欲、心率、呼吸、體溫等臨床指標。結果顯示基

7、因治療奶牛的精神、食欲、心率、呼吸、體溫等臨床指標在注射前后無顯著差異。另選取3頭患隱性乳腺炎的奶牛，通過乳房基部穿刺注射重組質粒p215C3LYZ，劑量為1600μg/頭，24 h后重復注射一次，定期采集試驗組奶牛的乳樣、糞樣、尿樣以及試驗牛舍的墊料、水樣，用PCR檢測重組質粒在試驗牛體內外的轉移擴散。結果發(fā)現除再次注射后24h可從奶樣中檢測到重組質粒外，其他樣品均為陰性，表明重組質粒不能在奶牛體內長期殘留，也不能在環(huán)境中擴散。于第二