小鼠活體內(nèi)泡狀棘球蚴熒光成像模型建立方法的探討.pdf

1、背景:
　　肝泡狀球蚴病作為一種重要的人畜共患寄生蟲(chóng)病威脅著北半球廣大牧區(qū)居民的生命安生。現(xiàn)有的治療肝泡球蚴病的藥物如阿苯達(dá)唑等往往對(duì)泡球蚴只能起到抑制作用，而對(duì)其的殺滅作用有限，對(duì)于少數(shù)病例甚至無(wú)效，且停藥后復(fù)發(fā)率較高，因此有必要進(jìn)一步尋找更佳的抗肝泡球蚴病的藥物。以往的肝泡球蚴藥敏實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭饕揽坑?jì)算囊濕重、免疫組織化學(xué)染色等病理解剖學(xué)手段觀察病灶對(duì)藥物的反應(yīng)情況，不僅操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力且無(wú)法對(duì)同一實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行縱向監(jiān)測(cè)。近十年

2、來(lái)，活體內(nèi)熒光成像技術(shù)的不斷發(fā)展使活體內(nèi)動(dòng)態(tài)觀察腫瘤、感染等病灶成為了可能。
　　目的:
　　建立一種活體小鼠體內(nèi)泡狀棘球蚴原頭節(jié)熒光成像模型，為今后的泡狀棘球蚴病體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供可動(dòng)態(tài)觀察的動(dòng)物模型。
　　方法:
　　從感染泡狀棘球蚴的實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)爪沙鼠體內(nèi)獲得泡球蚴囊泡，分離、研磨并過(guò)濾得到泡狀棘球蚴原頭節(jié)，體外培養(yǎng)。分別使用不同濃度的二甲雙胍、阿苯達(dá)唑及二者聯(lián)合處理原頭蚴，使用臺(tái)盼藍(lán)外排實(shí)驗(yàn)測(cè)定頭節(jié)活性。使用JC-

3、1線(xiàn)粒體膜電位指示劑對(duì)三組原頭節(jié)進(jìn)行染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并測(cè)定原頭節(jié)所發(fā)射出的紅/綠熒光比值以及紅、綠熒光各自隨時(shí)間的變化情況。隨后將三組原頭節(jié)分別種入三組BALB/c小鼠的肝被膜下，使用IVISLumina活體小動(dòng)物成像儀對(duì)小鼠進(jìn)行成像，測(cè)定紅/綠熒光比值并與體外測(cè)定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。最后觀察自然條件下（不使用抗包蟲(chóng)藥物）觀測(cè)JC-1熒光的衰減情況，繪制曲線(xiàn)。
　　結(jié)果:亞甲藍(lán)外排實(shí)驗(yàn)測(cè)得10 mM二甲雙胍處理組原頭節(jié)活性

4、為27.43％（51/186），低于對(duì)照組（96.27%,136/141）、1mM二甲雙胍處理組（90.01%,158/175）以及5mM二甲雙胍處理組（73.48%,113/153）（P＜0.05）。15μM阿苯達(dá)唑與10 mM二甲雙胍與聯(lián)合使用處理組的原頭節(jié)活性為4.63%（5/107），低于其與5mM二甲雙胍聯(lián)合處理組（46.30%,82/177）、與1mM二甲雙胍聯(lián)合處理組（69.73%,103/147）及15μM阿苯達(dá)唑單獨(dú)處

5、理組（82.35%,198/240）（P＜0.05）。
　　激光共聚焦顯微鏡下可觀察到阿苯達(dá)唑聯(lián)合二甲雙胍處理組的原頭節(jié)體內(nèi) JC-1紅綠熒光比值為0.29，低于二甲雙胍單獨(dú)處理組（1.06）及對(duì)照組（4.53）（P＜0.05）。說(shuō)明聯(lián)合處理組原頭節(jié)的線(xiàn)粒體功能較二甲雙胍單獨(dú)處理組和對(duì)照組明顯減退，與之前的亞甲藍(lán)外排實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，提示二甲雙胍是通過(guò)抑制原頭節(jié)的線(xiàn)粒體功能進(jìn)而導(dǎo)致能量代謝障礙起到抗泡球蚴作用的。在體外分別對(duì)上述三組

6、原頭節(jié)的紅、綠熒光作動(dòng)態(tài)觀察記錄，結(jié)果顯示聯(lián)合治療組的紅色熒光的衰減速度明顯快于二甲雙胍單獨(dú)治療組及對(duì)照組。到48小時(shí)后，三組紅色熒光之間無(wú)明顯差異，提示此時(shí)紅色熒光的衰減已經(jīng)影響到原頭節(jié)活性監(jiān)測(cè)的準(zhǔn)確性。綠色熒光方面，二甲雙胍處理組的綠色熒光在24h、36h和48h均明顯強(qiáng)于未處理組（P＜0.01），聯(lián)合處理組的綠色熒光24h和36h明顯強(qiáng)于二甲雙胍處理組。
　　將三組原頭節(jié)分別注射入小鼠的肝被膜下，進(jìn)行活體內(nèi)熒光成像。測(cè)得二甲

7、雙胍處理組原頭節(jié)的紅綠熒光比值明顯低于未處理組原頭節(jié)（P＜0.01），而聯(lián)合處理組原頭節(jié)的紅綠熒光比值又明顯低于二甲雙胍處理組（P＜0.01）。這與之前體外激光共聚焦測(cè)得的結(jié)果相吻合，說(shuō)明使用JC-1作為標(biāo)記物可以較好地進(jìn)行泡球蚴活體內(nèi)熒光成像，且病灶部位紅綠熒光比值可以較為準(zhǔn)確地反映此處泡球蚴原頭節(jié)的活性。對(duì)注射了未處理組原頭節(jié)的小鼠進(jìn)行動(dòng)態(tài)熒光成像監(jiān)測(cè)，結(jié)果示紅色熒光的衰減略快于綠色熒光，可能與非結(jié)合態(tài)的JC-1的抗熒光漂白能力強(qiáng)于