MLPA技術(shù)在單基因遺傳病DMD-BMD、SMA基因診斷中的應用.pdf

1、多重連接依賴性探針擴增(MLPA)是一種高通量、針對待測核酸中靶序列進行定性和相對定量分析的新技術(shù)。該技術(shù)具有分辨率高、操作簡便、設備要求低等諸多優(yōu)勢而廣泛用于檢測人類基因組內(nèi)拷貝數(shù)變異(CNV)。近年來,MLPA在技術(shù)與應用上又有許多新的發(fā)展,如運用化學合成法制備3’、5’探針,MLPA在基因甲基化檢測、基因表達水平分析、基因部分片段重復區(qū)域拷貝數(shù)分析及轉(zhuǎn)基因基因分型中的應用,并且MLPA與基因芯片微陣列技術(shù)的結(jié)合,使得多重連接探針擴

2、增真正具備了高通量檢測能力。本文就MLPA技術(shù)及其應用進展作一綜述。
　　 背景：假肥大型進行性肌營養(yǎng)不良癥(Duchenne and Beckermuscular dystrophy,DMD/BMD)、脊髓性肌肉萎縮癥(Spinal muscularatrophy,SMA)都是常見的的致死性單基因遺傳病,目前暫無有效的治療手段,所以檢測患者致病基因,開展攜帶者篩查和產(chǎn)前診斷以避免患兒的出生顯得尤為重要。傳統(tǒng)的DMD/BMD基因

3、診斷方法有缺失熱區(qū)21個外顯子.PCR檢測、實時熒光定量PCR和遺傳連鎖分析。各方法都存在一定的局限性:21個外顯子PCR檢測不能篩查雜合缺失和重復突變；實時熒光定量PCR雖能定量分析基因拷貝數(shù),但DMD基因較大,其檢測范圍難以覆蓋所有位點,所以一般只在已知患者突變位點時對女性親屬相應位點進行分析,又由于操作量大,在臨床上沒有廣泛應用；連鎖分析篩查攜帶者依賴于患者信息,且無法區(qū)分新發(fā)生突變而誤診攜帶者。傳統(tǒng)的SMA基因診斷方法為PCR.

4、酶切法,僅限于檢測SMN1基因7號外顯子純合缺失,未能檢出攜帶者?；谏鲜龇椒ǖ娜毕莺团R床需要,我們急需建立高效、準確、靈敏并適用于臨床大樣本檢測、不依賴患者信息的攜帶者篩查平臺,完善DMD/BMD、SMA基因診斷體系。
　　 目的：建立單基因遺傳病DMD/BMD與SMA的多重連接依賴性探針擴增技術(shù)(MLPA)檢測平臺,提高患者診斷率和攜帶者檢出率,并指導再生育。
　　 方法：①有患者參與診斷的DMD家系18個,無患者信

5、息的家系11個。18位患者已檢測了突變熱區(qū)21個外顯子的缺失情況,診斷率為66.7％(12/18),且通過STR遺傳連鎖分析均可確定X風險染色體。應用MLPA技術(shù)對29個DMD家系中5位已知缺失突變的患者、28位女性疑似攜帶者及1例胎兒行基因診斷。產(chǎn)前診斷通過SRY基因檢測確定性別。對缺失/重復型DMD攜帶者行實時熒光定量PCR驗證。②應用MLPA檢測8個SMA家系的4位SMA患者,12位疑似攜帶者。4位SMA患者已經(jīng)PCR-酶切法篩查

6、,結(jié)果提示SMN1的7號外顯子均為純合缺失。
　　 結(jié)果：DMD:①MLPA檢測到5位患者已知位點及其相鄰位點存在缺失突變。說明MLPA檢測范圍廣,結(jié)果準確可靠。②18位DMD患者進行了缺失熱區(qū)21個外顯子的檢測,診斷率為66.7％(12/18),應用MLPA技術(shù)后,在3個未篩查到缺失突變的DMD家系中發(fā)現(xiàn)了重復突變,DMD患者診斷率提高到83.3％(15/18)。聯(lián)合應用MLPA檢測、缺失熱區(qū)突變篩查和遺傳連鎖分析可為18個有

7、患者參與診斷的DMD家系提供信息,診斷率達100％(18/18)。③連鎖分析需在有患者參與的前提下才能進行攜帶者的篩查,而MLPA不依賴患者參與,即可對疑似攜帶者的致病基因行直接診斷。本研究應用MLPA篩查到11位DMD女性攜帶者(其中5位來自無患者信息的家系),結(jié)果經(jīng)實時熒光定量PCR驗證無誤。攜帶者診斷率為50％(11/22)。④一例產(chǎn)前診斷胎兒SRY檢測為陰性,其未遺傳到母親的缺陷基因,排除攜帶者身份。⑤5個家系(家系6-10)經(jīng)

8、遺傳連鎖分析提示,患者X致病染色體均遺傳白其母親。應用MLPA發(fā)現(xiàn)這5個家系DMD患者母親基因型正常,推知患者的缺失突變系新發(fā)生突變,突變新發(fā)生率為35.7％(5/14)。僅依靠連鎖分析篩查攜帶者有可能發(fā)生誤診,故生育指導時,仍需對疑似攜帶者行直接基因診斷。
　　 SMA:①4位SMA患者MLPA檢測結(jié)果:1號患者SMN1純合缺失；2號患者一拷貝SMN1缺失,另一拷貝轉(zhuǎn)變?yōu)镾MN2；3、4號患者基因型均表現(xiàn)為一拷貝SMN1裝變?yōu)?/p>

9、SMN2,另一拷貝僅7號外顯子轉(zhuǎn)變?yōu)镾MN2外顯子7。MLPA可判斷SMN1是發(fā)生了缺失還是轉(zhuǎn)換,檢測結(jié)果比PCR-酶切法更詳細。②PCR-酶切法不能篩查攜帶者,MLPA對12位SMA疑似攜帶者的SMN1/2基因拷貝數(shù)進行了相對定量,確定了攜帶者身份,為其再生育提供了有利信息,攜帶者診斷率為100％(12/12)。③本課題發(fā)現(xiàn)了8種SMN基因型。
　　 結(jié)論：MLPA是一種高效、靈敏、準確、性價比較高的DMD/BMD、SMA分子