細(xì)粒棘球蚴細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(EgERK1)基因的克隆、序列分析及功能的初步鑒定.pdf

1、目的：從細(xì)粒棘蚴（Echinococcus granulosus，Eg）中克隆細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（EgERK1）基因，進(jìn)行序列測(cè)定，生物信息學(xué)分析，構(gòu)建pET28a-EgERK1原核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)誘導(dǎo)、表達(dá)并純化重組rEgERK1，Western Blot檢測(cè)rEgERK1重組蛋白生物學(xué)特性，為進(jìn)一步研究該基因在寄生蟲與宿主相互作用中的功能奠定基礎(chǔ)。方法：設(shè)計(jì)EgERK1基因特異性引物，從新疆株細(xì)粒棘球蚴中提取總RNA，RT-PCR法擴(kuò)增

2、EgERK1基因，構(gòu)建pMD19-T/EgERK1質(zhì)粒，測(cè)序確定序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。構(gòu)建pET28a-EgERK1原核表達(dá)質(zhì)粒，測(cè)序鑒定插入序列正確性。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)rEgERK1-His重組蛋白，Ni-NTA His Bind Resin親合層析柱純化，SDS-PAGE法確定蛋白表達(dá)情況，Western Blot檢測(cè)其生物學(xué)功能。結(jié)果：RT-PCR擴(kuò)增出一條長(zhǎng)度為1100bp的條帶，測(cè)序結(jié)果顯示其長(zhǎng)度為1125bp，編碼374

3、個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為6.34，為一新基因，命名為EgERK1（EU701008）。同源性比較表明EgERK1與多房棘球絳蟲EmMPK1基因同源性為95.45%，與線蟲、酵母、果蠅和人類等ERK基因的同源性為43.04～61.88%。進(jìn)化樹分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)EgERK1和多房擊球絳蟲ERK基因（EmMPK1）相聚集。功能分析預(yù)測(cè)EgERK1具有ERK類激酶T-X-Y結(jié)構(gòu)保守區(qū)和酶激活功能域。成功構(gòu)建了pET28a-EgERK1原核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)IP

4、TG誘導(dǎo)，SDS-PAGE檢測(cè)表明rEgERK1-His重組蛋白得到成功表達(dá)，在相對(duì)分子量47KDa處有表達(dá)條帶；Western Blot分析顯示rEgERK1-His重組蛋白能被特異性抗人ERK1/2單克隆抗體識(shí)別。結(jié)論：首次克隆細(xì)粒棘球蚴EgERK1新基因，成功構(gòu)建高效融合表達(dá)基因工程菌株pET28a-EgERK1，成功誘導(dǎo)表達(dá)并純化EgERK1重組蛋白，發(fā)現(xiàn)EgERK1重組蛋白具有與ERK1/2抗體結(jié)合的功能，為進(jìn)一步研究該基因在