肝細胞癌MAGE-A9基因的克隆、表達及特性鑒定.pdf

1、南京醫(yī)科大學碩士學位論文肝細胞癌MAGEA9基因的克隆、表達及特性鑒定姓名：徐璐申請學位級別：碩士專業(yè)：病理學指導教師：馮振卿20050420南京醫(yī)科大學碩士學位論文MAGE—A9基因，經(jīng)T—A連接克隆_@pMDl8一T載體，測序，并與GenBank數(shù)據(jù)庫登錄的MAGEA9cDNA序列比對。2限制性酶切圖譜鑒定pMDl8一T—MAGEA9克隆載體。采用質(zhì)粒抽提、純化、酶切、連接、感受態(tài)細菌制備和轉化等技術，構建并鑒定原核表達載體。藥物誘

2、導MAGEA9蛋白表達，SDS—PAGE7tWesternblot初步鑒定表達結果，然后將細菌表達產(chǎn)物超聲裂解，再用HiTrap親和柱純化超聲裂解上清。3MAGEA9蛋白純化產(chǎn)物免疫BALB／c小鼠。取對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤SP2／O細胞與免疫小鼠的脾細胞按常規(guī)PEG方法融合，有限稀釋法克隆細胞。ELISA法檢測雜交瘤培養(yǎng)上清與MAGEA9蛋白的效價，Dotblot檢驗細胞培養(yǎng)上清與MAGE—A9的結合活性。4免疫組4tABC法檢壩JM

3、AGEA9基因在Hcc組織中的表達及細胞定位。研究結果1擴增出約945bp的MAGE—A9基因，測序證實其序列與GenBank數(shù)據(jù)庫報道序列完全一致。2限制酶切結果顯示克隆載體pMDl8T—MAGEA9構建成功。原核分泌型表達系統(tǒng)pBAD／gIII州AGE—A9在大腸桿菌Topl0中被誘導表達，獲得有多聚組氨酸(His)。標簽序列的重組表達蛋白，冷凍超聲裂菌法分離結果顯示MAGE—A9表達蛋白在菌體大部分為可溶性表達。用HiTrap柱純