LRIG2基因全長及胞外段對膠質母細胞瘤細胞系生物學特性的影響及其機制.pdf

1、第一部分 LRIG2全長及胞外段慢病毒表達載體的構建及其在膠質母細胞瘤中的亞細胞定位
　　目的：構建LRIG2基因全長及胞外段的慢病毒表達載體,建立穩(wěn)定轉染的人膠質母細胞瘤細胞系,并觀察其蛋白的亞細胞定位。
　　方法：PCR擴增LRIG2基因全長(LRIG2)和胞外段(LRIG2ecto)片段,運用基因重組技術分別將片段插入慢病毒表達載體pLVX-Puro-3×Flag;將測序成功的載體pLVX-Puro-3×Flag-LR

2、IG2和pLVX-Puro-3×Flag-LRIG2ecto包裝成慢病毒后分別轉染膠質瘤細胞系U87,U251;嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定細胞株。WesternBlot和Real-timeRT-PCR檢測穩(wěn)定株中LRIG2蛋白和mRNA的表達。激光共聚焦檢測LRIG2全長及胞外段蛋白的亞細胞定位。
　　結果：LRIG2全長及胞外段重組質粒測序序列完全正確。成功得到過表達LRIG2及LRIG2ecto的U87,U251穩(wěn)定株,U87中LR

3、IG2及LRIG2ecto過表達組相應的mRNA表達分別是對照組的8.42±0.50和29.58±0.98倍;U251中分別是對照組的65.83±4.14和126.34±0.98倍(P<0.01)。免疫熒光顯示在U87及U251中,LRIG2及LRIG2ecto均主要是在胞漿表達,未見細胞核區(qū)的表達。
　　結論：成功建立穩(wěn)定表達外源性LRIG2基因全長及胞外段的人膠質母細胞瘤細胞株,過表達產(chǎn)物主要定位于胞漿。
　　第二部分

4、LRIG2全長及胞外段對膠質母細胞瘤細胞系增殖和凋亡的影響及其機制
　　目的：探討過表達LRIG2全長(LRIG2)及胞外段(LRIG2ecto)基因對膠質母細胞瘤細胞系U87,U251增殖、凋亡的影響及其機制。
　　方法：通過CCK8法檢測細胞增殖及細胞活性,免疫熒光染色檢測Ki67的表達,PI染色后流式細胞術檢測細胞周期變化,WesternBlot檢測細胞周期蛋白,EGFR信號通路相關蛋白及PDGFRβ,cMet蛋白的表

5、達,AnnexinV-FITC/PI雙染后行流式細胞術檢測細胞凋亡,JC-1染色后行流式細胞術檢測細胞線粒體膜電位。
　　結果:與對照組相比,LRIG2及LRIG2ecto過表達組U87,U251細胞增殖率均明顯高于對照組,Ki67陽性細胞百比分均明顯高于對照組,細胞周期檢測細胞增殖指數(shù)(PI)均明顯高于對照組。在U87細胞中,LRIG2及LRIG2ecto過表達組細胞凋亡率分別為(2.86±0.30)％,(4.04±0.59)%

6、,明顯低于對照組的(5.9±0.45)%;在U251細胞中,LRIG2及LRIG2ecto過表達組細胞凋亡率分別為(4.12±0.26)%,(3.62±0.24)%,明顯低于對照組(5.48±0.65)%。在含血清培養(yǎng)條件下,LRIG2及LRIG2ecto過表達組U87,U251細胞中EGFR及磷酸化EGFR水平表達增加,其下游的磷酸化Akt及磷酸化Erk表達水平均較對照組明顯增加;在無血清培養(yǎng)及EGF刺激作用下,刺激時間為5min時,

7、LRIG2及LRIG2ecto過表達組中磷酸化EGFR及磷酸化Akt的表達水平較對照組明顯增高。在EGFR抑制劑吉非替尼作用下,LRIG2及LRIG2ecto過表達明顯增強U87,U251細胞存活率,增加U251細胞線粒體膜電位及降低其細胞凋亡率。LRIG2及LRIG2ecto過表達U87細胞PDGFRβ表達明顯增加;LRIG2及LRIG2ecto過表達組U87,U251細胞cMet表達明顯增加。
　　結論:LRIG2基因全長及胞

8、外段均可促進人膠質母細胞瘤細胞增殖,抑制其凋亡,增強酪氨酸激酶受體EGFR,PDGFRβ及cMet表達,激活EGFR及下游信號通路,增強對EGFR抑制劑的治療抵抗,有望成為膠質母細胞瘤新的分子治療靶點。
　　第三部分 LRIG2全長及胞外段對膠質母細胞瘤細胞系遷移和侵襲的影響
　　目的:探討過表達LRIG2全長(LRIG2)及胞外段(LRIG2ecto)基因對膠質母細胞瘤細胞系遷移和侵襲的影響。
　　方法:劃痕實驗檢測

9、細胞遷移,Transwell小室侵襲實驗檢測細胞的侵襲能力,明膠酶譜檢測細胞培養(yǎng)基中基質金屬蛋白酶2(MMP2)的表達,real-timeRT-PCR檢測MMP2mRNA的表達。
　　結果:LRIG2及LRIG2ecto過表達組U251細胞48h遷移像素分別為:(7.61±0.32)×105和(8.34±0.42)×105,明顯小于對照組細胞(10.17±0.31)×105。U87中,LRIG2及LRIG2ecto過表達組侵襲細胞

10、數(shù)分別為(49.38±4.21)%和(59.49±6.02)%,明顯低于對照組細胞(100±9.11)%;U251中,LRIG2及LRIG2ecto過表達組侵襲細胞數(shù)分別為(36.7±4.09)%和(49.54±5.81)%,明顯低于對照組細胞(100±10.01)%。U87,U251中LRIG2及LRIG2ecto過表達組培養(yǎng)基中MMP2的活性均明顯低于相應對照組細胞,U251中LRIG2及LRIG2ecto過表達組MMP-2mRNA