siRNA抑制HMGA1基因表達對LX-2細胞生物學(xué)功能的影響.pdf

1、目的:
　　探討HMGA1 siRNA對人肝星狀細胞LX-2中HMGA1、a-SMA、E-cad基因的表達調(diào)控作用,及增殖活性的影響,并探討其可能的機制。
　　方法:
　　1.選擇體外培養(yǎng)LX-2細胞作為研究對象,分別設(shè)立以下六組:①正常對照組;②空白對照組;③陰性對照組;④轉(zhuǎn)染HMGA1- siRNA-1;⑤轉(zhuǎn)染HMGA1- siRNA-2;⑥轉(zhuǎn)染HMGA1- siRNA-3。轉(zhuǎn)染48h后收集各組細胞。采用半定量RT

2、-PCR檢測和Western blot印跡法檢測HMGA1的mRNA和蛋白表達,篩選出干擾效果最佳的siRNA序列。
　　2.選擇體外培養(yǎng)LX-2細胞作為研究對象,加入不同濃度的TGF-β1(終濃度1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml)孵育,并配對照組。于24h后收集細胞,提取LX-2細胞總RNA及總蛋白。用半定量RT-PCR及Western blot印跡方法檢測TGF-β1對LX-2細胞HMGA1的mRNA和蛋白表達的影響

3、。
　　3.采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法對LX-2細胞進行HMGA1 siRNA瞬時轉(zhuǎn)染,將細胞分為4組:①正常對照組、②TGF-β1刺激組、③TGF-β1+ NC-siRNA組和④TGF-β1+ HMGA1-siRNA組。采用半定量RT-PCR及Western blot印跡法對LX-2細胞中HMGA1、α-SMA和E-cad的mRNA及蛋白表達水平進行檢測,采用MTT法對LX-2細胞增殖水平進行檢測。
　　結(jié)果:
　　1.半定量

4、RT-PCR和Western blot印跡法檢測HMGA1的表達:與正常對照組、空白對照組、陰性對照組相比,3個干擾組細胞 HMGA1基因和蛋白表達水平均明顯降低(P﹤0.05),其中干擾組HMGA1-siRNA-1的干擾效果最好(P﹤0.01)。
　　2.隨著TGF-β1劑量加大,HMGA1基因表達水平逐漸升高,各組間也有顯著差異(P﹤0.05)。
　　3. TGF-β1刺激組與TGF-β1+NC-siRNA組之間細胞增殖

5、水平及HMGA1、α-SMA、E-cad的基因及蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義( P﹥0.05),細胞增殖水平及HMGA1、α-SMA表達均明顯高于正常對照組(P﹤0.05),E-cad表達顯著低于正常對照組(P﹤0.05),而TGF-β1+ HMGA1 siRNA組細胞增殖水平及HMGA1、α-SMA的基因及蛋白表達水平與TGF-β1刺激組及TGF-β1+NC-siRNA組相比均顯著下降(P﹤0.05),E-cad表達水平顯著增高(P﹤

6、0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.靶向HMGA1的siRNA能夠沉默人肝星狀細胞LX-2中HMGA1的表達,以HMGA1-siRNA序列1組沉默效果最好。
　　2. TGF-β1作用于人肝星狀細胞LX-2,對HMGA1基因表達有顯著的上調(diào)作用。
　　3.干擾HMGA1基因可顯著抑制TGF-β1對人肝星狀細胞LX-2中α-SMA基因和蛋白表達的促進作用;同時也可減輕對 E-cad表達的抑制作用,抑制TGF-β1誘導(dǎo)