siRNA沉默HIF-1α基因?qū)η傲邢侔㏄C3細(xì)胞生物學(xué)行為及多西紫杉醇化療和放療敏感性的影響.pdf

1、前列腺癌是泌尿生殖系最常見的惡性腫瘤之一，主要治療手段有根治性手術(shù)和內(nèi)分泌治療、放療及化療。根治術(shù)后局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及許多無手術(shù)機(jī)會的患者，常選擇內(nèi)分泌治療。接受內(nèi)分泌治療的患者，大多數(shù)起初有效，但經(jīng)過中位時間14～30個月后，幾乎都將逐漸發(fā)展為激素非依賴性前列腺癌或激素難治性前列腺癌，激素治療將不再有效。如何有效地治療激素非依賴性前列腺癌或激素難治性前列腺癌依然是基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。RNA干擾(RNAi)是利用小RNA(包括

2、小干擾RNA即siRNA)序列抑制特定基因信號的過程，直到目前，尚未發(fā)現(xiàn)哺乳動物有內(nèi)源表達(dá)的siRNA。若能將人工合成的具有特定序列的siRNA導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，有可能引起具有同源序列基因的mRNA降解，從而有效地抑制該基因的表達(dá)，影響腫瘤的生物學(xué)行為。近年來，RNAi技術(shù)的發(fā)展為前列腺癌治療的研究提供了一種新思路。包括前列腺癌在內(nèi)的腫瘤細(xì)胞對放化療等治療措施的敏感性與組織是否缺氧有關(guān)。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)調(diào)控的眾多下游基因

3、參與了血管生成、血紅蛋白的合成、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和糖酵解、細(xì)胞的增殖與凋亡等腫瘤乏氧適應(yīng)的生物學(xué)過程。文獻(xiàn)報(bào)道和我們的前期研究證實(shí)：前列腺癌中HIF-1α在mRNA水平和蛋白水平均呈高表達(dá)，且與前列腺癌的惡性生物學(xué)行為有關(guān)。本課題設(shè)計(jì)思路：首先，體外化學(xué)合成7條siRNA，通過脂質(zhì)體包裹后轉(zhuǎn)染前列腺癌PC3細(xì)胞，觀察HIF-1α-siRNA的干擾效果，篩選出最有效的siRAN，然后用它來進(jìn)行RNAi以觀察對PC3細(xì)胞生物學(xué)行為如生長增殖、侵襲

4、遷移及凋亡等的影響，再聯(lián)合多西紫杉醇化療及放療來觀察siRAN沉默HIF-1α對PC3細(xì)胞化療及放療的敏感性的影響，以期為前列腺癌的治療提供一種新思路。本研究分四個部分：
　　 第一部分：設(shè)計(jì)、合成靶向HIF-1α基因的siRNA序列，并篩選出最有效的序列，為后續(xù)研究提供依據(jù)。
　　 方法：針對人類HIF-1α基因mRNA(NM_001530)序列設(shè)計(jì)并化學(xué)合成七條siRNA及兩條陰性對照序列。選擇40nM作為siRNA

5、的轉(zhuǎn)染終濃度，轉(zhuǎn)染后24、48、72小時用Real-Time-PCR檢測PC3細(xì)胞HIF-1α-mRNA表達(dá)水平的變化；在siRNA轉(zhuǎn)染后48小時用western-blotting檢測PC3細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)水平的變化。
　　 結(jié)果：1號及5號序列HIF-1α-siRNA轉(zhuǎn)染24小時后的干擾效果在所有序列中較好，mRNA抑制率均在70[％]以上。HIF-1α-siRNA干擾的時效性檢測顯示1號序列及5號序列在mRNA水平干

6、擾效果最佳的時間是轉(zhuǎn)染后24～48小時。轉(zhuǎn)染后48小時western blot檢測HIF-1α蛋白水平，結(jié)果顯示序列1干擾效果最好，蛋白水平下降了70[％]以上。
　　 結(jié)論：7條HIF-1α-siRNA中，靶位點(diǎn)為792-812的1號HIF-1α-siRNA轉(zhuǎn)染48小時后在mRNA水平和蛋白水平的干擾效果均較好，抑制率均在70[％]以上；因此確定用1號HIF-1α-siRNA來進(jìn)行后續(xù)研究。1號HIF-1α-siRNA最好的干

7、擾效果可能發(fā)生在轉(zhuǎn)染后24～48小時左右。
　　 第二部分：探討用1號siRNA(HIF-1α-siRNA1)沉默HIF-1α基因?qū)η傲邢侔㏄C3細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)分為PC3組、PC3+NC siRNA組和PC3+HIF-lα-siRNA1三組；采用脂質(zhì)體包裹已被證實(shí)有效的HIF-1α-siRNA1轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞；用CCK-8法測各組PC3細(xì)胞生長增殖情況；劃痕試驗(yàn)法觀察細(xì)胞的遷移能力；Transw

8、ell法觀察細(xì)胞的侵襲力；流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI法測量細(xì)胞的凋亡率。
　　 結(jié)果：⑴CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后24、48、72、96小時PC3+HIF-lα-siRNA1組細(xì)胞存活率明顯低于PC3組和PC3+NC siRNA組(P<0.05)，兩對照組無顯著性差異(P>0.05)；48h～72h抑制作用最明顯。⑵劃痕法測定顯示PC3+HIF-lα-siRNA1組細(xì)胞遷移能力明顯低于對照組(P<0.01)；兩

9、對照組無顯著性差異(P>0.05)。⑶Transwell測定顯示：PC3+HIF-lα-siRNA1組穿過Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)明顯少于PC3組和PC3+NC siRNA組(P<0.01)，兩對照組無顯著性差異(P>0.05)。(4)轉(zhuǎn)染后48小時空白對照組、陰性對照組、干擾組PC3+HIF-lα-siRNA1組凋亡率分別為2.4[％]、2.5[％]、11.2[％]，干擾組凋亡率明顯高于對照組(P<0.01)。
　　 結(jié)論：

10、①沉默HIF-lα基因抑制了PC3細(xì)胞的生長；②沉默HIF-lα基因降低了PC3細(xì)胞的遷移力和侵襲力；③沉默HIF-lα基因?qū)C3細(xì)胞的凋亡有促進(jìn)作用。
　　 第三部分：觀察siRNA沉默HIF-1α基因?qū)C3細(xì)胞多西紫杉醇化療敏感性的影響。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)分為PC3+DTX組、PC3+NC siRNA+DTX組和PC3+HIF-lα-siRNA1+DTX三組，每組另外設(shè)一個未化療的平行對照組。轉(zhuǎn)染后24小時起給予

11、終濃度為0.25μM多烯紫杉醇，CCK-8法測各組細(xì)胞生長增殖變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡率和細(xì)胞的周期分布，并檢測多藥耐藥基因蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：化療48小時后PC3+HIF-lα-siRNA1+DTX組細(xì)胞存活數(shù)明顯低于PC3+DTX組和PC3+NC siRNA+DTX組 (P<0.01)，兩化療對照組間無顯著性差異。化療后48小時PC3+DTX組、NC siRNA+DTX組、PC3+HIF-lα-siRNA1+DT

12、X凋亡率分別為15.6[％]、14.8[％]、21.3[％]，PC3+HIF-lα-siRNA1+DTX組凋亡率高于對照組(P<0.01)。流式細(xì)胞儀測定化療后48小時各組PC3細(xì)胞的周期分布，結(jié)果顯示未化療的HIF-lα-siRNA1轉(zhuǎn)染組PC3細(xì)胞發(fā)生了G0/G1期阻滯解除。PC3+DTX組、NC siRNA+DTX組、PC3+HIF-lα-siRNA1+DTX組PC3細(xì)胞化療前與化療后48小時多藥耐藥基因蛋白表達(dá)均無差異。

13、　　 結(jié)論：HIF-lα-siRNA1轉(zhuǎn)染能增加PC3細(xì)胞對多烯紫杉醇化療的敏感性。沉默HIF-lα基因?qū)C3細(xì)胞多烯紫杉醇的化療增敏作用與凋亡率升高及G0/G1期阻滯解除有關(guān)，但與多藥耐藥基因蛋白的表達(dá)無明顯相關(guān)。
　　 第四部分：觀察siRNA沉默HIF-1α基因?qū)η傲邢侔㏄C3細(xì)胞的體外放射治療作用的影響，并初步探討可能涉及的機(jī)制。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)分組同前。采用細(xì)胞增殖克隆形成法測定不同劑量放射治療后的克隆形

14、成數(shù)，經(jīng)單靶多擊模型分析計(jì)算D0、準(zhǔn)閾劑量Dq、2Gy時的存活率SF2、外推值N、放射增敏比SER，繪制細(xì)胞放射劑量-存活曲線。CCK-8法測定各組PC3細(xì)胞單次6Gy照射后不同時間的存活曲線。流式細(xì)胞術(shù)分析各組PC3細(xì)胞放療后72小時的凋亡率和放療前及放療后72小時的細(xì)胞周期分布。
　　 結(jié)果：⑴RADIOMED軟件分析顯示PC3+HIF-lα-siRNA1組D0、SF2、Dq、N值均低于PC3組和PC3+NC siRNA組，

15、以D0計(jì)算，PC3+HIF-lα-siRNA1組相對于PC3組的放射增敏比SER為1.24。⑵方差分析CCK-8法測定結(jié)果顯示放療24h以后PC3+HIF-lα-siRNA1組細(xì)胞生長明顯慢于PC3組、PC3+NC siRNA組(P<0.01)，兩對照組間無明顯差異(P>0.05)。⑶6Gy放射治療后72小時流式細(xì)胞儀測定顯示PC3組與PC3+NC siRNA組間細(xì)胞凋亡率無明顯差異(P>0.05)。PC3+HIF-lα-siRNA1組

16、凋亡率較高，與兩對照組比較有明顯差異(P<0.01)。⑷流式細(xì)胞儀測定放療前和6Gy單次放射治療后72小時各組PC3細(xì)胞的周期分布，結(jié)果顯示放療前HIF-lα-siRNA1轉(zhuǎn)染組PC3細(xì)胞發(fā)生了G0/G1期阻滯解除。
　　 結(jié)論：①HIF-lα-siRNA1沉默HIF-lα基因的表達(dá)增強(qiáng)了PC3細(xì)胞的放射敏感性。②沉默HIF-lα基因引起的放射增敏作用可能與放療后PC3細(xì)胞的修復(fù)力下降、氧化應(yīng)激損傷增加、凋亡率升高及G0/G1期