TOLL樣受體4-核轉錄因子--κB信號通路在脂多糖誘導奶牛乳腺炎癥反應中的作用.pdf

1、奶牛乳房炎通常就是指乳腺發(fā)生了炎癥，是由多種因素引起嚴重程度不同的復雜疾病。最后會由于環(huán)境、病原體以及宿主的不同而導致不同的后果，因此治療代價較高且不容易治愈。當致病菌進入到無菌環(huán)境，常常會破壞一些物理屏障如乳頭而引起乳房炎，這就需要及時和適當?shù)乃拗鞣烙鶃矸乐辜毦淖躺苊庋装Y的加劇。另一方面，這些傳染性病原體如金黃色葡萄球菌和鏈球菌很容易從感染牛的一個乳區(qū)蔓延到其它乳區(qū)或者是其它的牛。像年齡、泌乳階段和體細胞評分這些因素都會影響牛感染

2、乳房炎的幾率。不同的病原體會引起不同的乳房炎從而導致乳腺組織產(chǎn)生不同的免疫反應，因此宿主需要根據(jù)病原體的情況來產(chǎn)生相應的應答從而保護機體免受感染。
　　本試驗以中國荷斯坦奶牛的乳腺組織和乳腺上皮細胞為研究對象，研究了炎癥信號通路的作用機制。通過組織學觀察正常和乳房炎乳腺組織的結構差異，采用基因芯片的方法分析了TLR4/ NF-κB炎癥信號通路在正常與乳房炎乳腺組織中的基因表達情況;利用體外培養(yǎng)的方法，研究了化學抑制和siRNA抑制

3、NF-κB基因對乳腺上皮細胞中TLR4/NF-κB信號通路關鍵基因表達的影響;運用蛋白質組iTRAQ技術，篩選激活和抑制p65條件下乳腺上皮細胞中的差異蛋白。
　　1.荷斯坦奶牛正常與乳房炎乳腺組織的基因表達譜芯片分析
　　宿主感染乳房炎后會引起Toll樣受體4介導的核轉錄因子κB信號通路的激活，從而促進了炎癥相關基因的表達和先天免疫反應。在本試驗中，運用基因芯片技術和生物信息學分析了正常與感染乳房炎乳腺組織中的全部基因表達

4、水平的情況。在這些基因中對參與TLR4/NF-κB信號通路的基因進行分析發(fā)現(xiàn)，共產(chǎn)生48個差異表達的基因，與正常組織相比較，其中有19個基因在感染乳房炎乳腺組織中表達上調(diào)，有29個基因表達下調(diào)。同時挑選了主要的10個基因CD14、TNF-α、MD-2、IL-1β、NF-κB、IL-12、TLR4、MyD88、IL-6和IL-10進行了熒光定量PCR驗證，挑選了4個基因進行Western-blot驗證，結果顯示與正常乳腺組織相比較TLR4

5、、MyD88、IL-6和IL-10在患乳房炎乳腺組織中表達上調(diào)，CD14、TNF-α、MD-2、IL-1β、NF-κB和IL-12表達下調(diào)，與芯片結果一致。對這些差異表達的基因，利用生物信息學數(shù)據(jù)庫資源如GO和KEGG進行分析，發(fā)現(xiàn)這些基因調(diào)控著與免疫功能相關的不同通路。
　　2.化學干涉抑制NF-κB基因對TLR4/NF-κB信號通路表達的影響
　　研究表明，脂多糖是革蘭氏陰性菌外膜的主要組成成分，在炎癥反應的誘導中起著關

6、鍵的作用。LPS信號主要通過TLR4激活NF-κB從而誘導炎性介質的產(chǎn)生。本試驗利用乳腺上皮細胞體外培養(yǎng)的方法，研究NF-κB基因的特異性化學抑制劑bay11-7082對乳腺細胞內(nèi)TLR4/NF-κB信號通路關鍵基因表達的影響。試驗采用常用的組織塊接種法，得到純度較高的乳腺上皮細胞，隨后進行LPS處理細胞建立炎癥模型和NF-κB基因抑制實驗。結果表明LPS能夠激活TLR4/NF-κB信號通路。通路上的一些基因如TLR4、NF-κB、My

7、D88、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平表達增加以及TLR4、NF-κB、IL-1β和TNF-α的蛋白含量增加。Bay11-7082處理細胞后，NF-κB的表達顯著下降，對LPS誘導的乳腺上皮細胞IL-1β和TNF-α的釋放減少，炎癥信號通路上的基因如TLR4、MyD88和IL-6的表達都有一定程度的降低。
　　3.基因干涉NF-κB基因表達對乳腺上皮細胞炎癥通路相關基因的影響
　　為了使試驗設計更加嚴謹，試驗

8、結果具有可重復性，除了化學抑制NF-κB基因還通過基因干涉來沉默NF-κB基因，從而觀察對乳腺上皮細胞TLR4/NF-κB信號通路相關基因的影響。在得到純度較高的牛乳腺上皮細胞后，進行NF-κB基因干擾試驗。結果表明，NF-κB-siRNA處理細胞后抑制了NF-κB基因從細胞質到細胞核的移位。同時促炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達明顯下降。TLR4/NF-κB信號通路上的一些主要基因如TLR4、NF-κB、MyD88和IL-6的表達

9、明顯下降而CD14、IL10和MD-2的表達卻顯著增加。結果與化學抑制試驗相一致。
　　4.激活和抑制p65條件下乳腺上皮細胞差異蛋白質的篩選
　　除了在基因水平觀察NF-κB基因對炎癥通路的影響，更從蛋白的水平來篩選激活和抑制前后的差異蛋白質。在本試驗中，分別將乳腺上皮細胞進行3組處理:不作任何處理的乳腺上皮細胞;用LPS處理的乳腺上皮細胞;用 LPS乖bay11-7082處理的乳腺上皮細胞，運用相對和絕對定量技術和液相色

10、譜法識別不同的調(diào)節(jié)蛋白。將LPS組與不作處理組相比較獲得差異表達的蛋白，將加入LPS和bay11-7082組與LPS組進行比較獲得相應的差異蛋白。共篩選出17個蛋白，其中有8個蛋白在LPS組表達顯著下調(diào)，在bay11-7082組表達卻顯著上調(diào)，有9個蛋白在LPS組表達顯著上調(diào)，在bay11-7082組表達顯著下調(diào)。P65蛋白與LPS vs空白組中差異蛋白質的互作關系網(wǎng)絡圖，途中共有225個點，形成兩兩相互作用關系有717個，p65蛋白與

11、bay11-7082vs LPS中差異蛋白質的相互作用關系網(wǎng)絡圖，圖中共有56個點，形成的兩兩互作關系有77個。
　　綜上所述，得出以下結論:
　　1.在正常與乳房炎乳腺組織中篩選出了參與TLR4/NF-κB信號通路的48個差異表達的基因，這些基因還分別參與了TOLL樣受體信號通路、MAPK信號通路以及細胞凋亡等過程，結果表明乳腺組織在細菌的感染后會通過TLR4/NF-κB通路釋放細胞因子和趨化因子。
　　2.在LPS

12、誘導的炎癥模型中，激活了TLR4/NF-κB信號通路，上調(diào)了炎癥因子的表達，致細胞損傷，通過化學抑制和siRNA干擾兩種抑制方法沉默NF-κB，均下調(diào)了炎癥因子的表達，并影響炎癥信號通路上相關基因的表達。
　　3.在抑制和激活條件下，蛋白芯片共篩選出17個差異表達蛋白，在P65蛋白與LPS vs空白組中差異蛋白質的互作關系網(wǎng)絡圖中，篩選出了與p65蛋白連接度和壓力向心性較高的13個基因;在p65蛋白與bay11-7082 vs L