水產品中副溶血性弧菌幾種檢測方法的研究.pdf

1、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)食源性疾病位居微生物性食源性疾病之首，已經成為我國一個嚴重的食源性公共衛(wèi)生問題之一。副溶血性弧菌的快速檢測技術是致病微生物研究的熱點之一，本文利用PCR原理建立了多種快速檢測方法，并應用于青島市部分水產品的檢測，取得了良好的效果。
　　 本文首先以副溶血性弧菌為對象，采用正交實驗對其增菌培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，經過實驗發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)溫度、起始pH和培養(yǎng)基鹽分對副溶血性弧菌生長有顯

2、著性影響，其最佳培養(yǎng)條件為：起始pH為7.5，培養(yǎng)溫度為34℃，搖床轉速為180r/min，培養(yǎng)基鹽分為3.5％，培養(yǎng)時間為22 h。
　　 在細菌培養(yǎng)的基礎上，本文建立了普通PCR快速檢測水產品中副溶血性弧菌的方法，菌液靈敏度103CFU/mL，對于含副溶血性弧菌1～10 CFU/g以上的樣品經增菌6 h后即可檢出。該方法特異性強、準確度高，將檢測周期縮短到10 h，適合水產品中副溶血性弧菌的快速檢測。將PCR方法與國家標準(

3、GB/T4789.7-2003)方法進行了比較，結果顯示PCR方法的靈敏性高于國標方法。
　　 為了進一步區(qū)別致病和非致病性副溶血性弧菌，本文針對副溶血性弧菌的tlh和tdh兩基因成功地建立了雙重PCR，用分子生物學手段實現(xiàn)了副溶血性弧菌兩種不同致病類型的區(qū)分。將雙重PCR應用于水產品中副溶血性弧菌的檢測，并初步得出了青島市水產品中副溶血性弧菌污染的數(shù)據，總檢出率為56.98％，致病性副溶血性弧菌的檢出率為1.74％。
　

4、　 隨后，本實驗還建立了SYBR GreenⅠ實時定量PCR檢測副溶血性弧菌的方法。采用四步法，即在變性、退火、延伸三步之后，引入第四步80℃收集熒光信號，此時，引物二聚體已經完全處于解鏈狀態(tài)，而特異性產物仍然處于雙鏈狀態(tài)，此時收集的熒光信號可真實的反映特異性產物的產量。該方法檢測樣品DNA的最低量為103copies，在模板濃度104～108copies/μL時，其對數(shù)值與CP值之間呈現(xiàn)良好的線性關系，定量準確。
　　 最后

5、，本實驗將PCR-ELISA方法引入了副溶血性弧菌的檢測，設計了針對tlh、tdh基因兩對特異性引物和探針，構建了tlh基因的克隆載體用于定量分析，建立了PCR-ELISA定量檢測副溶血性弧菌砌和tdh基因的方法，檢測DNA最低量為103copies。
　　 通過上述幾種檢測方法以及目前應用的一些副溶血性弧菌檢測方法的比較，可以看出：關于定性方法，國標檢測方法的成本以及對儀器要求較低，但檢測周期過長且操作繁瑣，不宜對食品中副溶血

6、性弧菌進行即時的檢測；利用全自動微生物鑒定儀對副溶血性弧菌進行檢測成本較高，該儀器設備昂貴，中小型實驗室難以承受；分子生物學技術PCR方法引入副溶血性弧菌的檢測，使得檢測周期大大縮短，所需儀器設備要求適中，且結果準確、靈敏度高適合各類實驗室開展檢測任務。關于定量方法，利用MPN法(行業(yè)標準SN0173-92)對副溶血性弧菌進行定量，檢測周期4～5d，且定量較為粗放；而利用熒光定量方法或者PCR-ELISA方法進行定量結果相對準確，且大大