人胰腺干細(xì)胞生物學(xué)特性的研究.pdf

1、糖尿病已成為繼心血管疾病和腫瘤之后的人類第三大疾病。目前糖尿病患者多采用外源胰島素來(lái)控制血糖水平，但是不可避免會(huì)產(chǎn)生低血糖癥狀。近年來(lái)，胰島移植已經(jīng)發(fā)展成為有望嚴(yán)格控制血糖水平的糖尿病治療方法。由于供體胰腺的短缺，人們開(kāi)始尋找胰島的替代資源，如干細(xì)胞、豬胰島等。胰腺干細(xì)胞是存在于胰腺組織中、能自我更新、具有多向分化潛能的一類成體干細(xì)胞。胰腺干細(xì)胞體外增殖分化為胰島細(xì)胞的途徑具有方法簡(jiǎn)便、成功率高、致瘤風(fēng)險(xiǎn)小和無(wú)倫理因素制約等優(yōu)勢(shì)，有望率

2、先用于治療糖尿病。 本實(shí)驗(yàn)室于2004年建立一株人胰腺干細(xì)胞系，但對(duì)其生物學(xué)特性僅進(jìn)行了初步檢測(cè)。本研究以該胰腺干細(xì)胞為試驗(yàn)材料，對(duì)其表達(dá)特征、生長(zhǎng)特性、體內(nèi)外分化能力進(jìn)行了較為系統(tǒng)的鑒定，以進(jìn)一步完善其生物學(xué)特性的檢測(cè)；同時(shí)將其體外定向誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞團(tuán)并植入糖尿病大鼠模型體內(nèi)，觀察其改善糖尿病癥狀的效果，旨在為糖尿病的臨床治療研究提供一株背景清楚的種子細(xì)胞。本研究主要內(nèi)容包括： 1 人胰腺干細(xì)胞的生物學(xué)特性免疫組

3、化染色結(jié)果顯示，該胰腺干細(xì)胞表達(dá)PDX-1、Nestin、CK7、CK19、胰高血糖素、生長(zhǎng)抑素、胰多肽、GLUT2、E-鈣黏素、波形蛋白、AFP和PCNA，不表達(dá)胰島素和胰淀素；RT-PCR進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄PDX-1、Nestin、CK7、CK19、GLUT2和β-Gal基因，不轉(zhuǎn)錄胰島素基因；流式細(xì)胞儀分析顯示，該胰腺干細(xì)胞表達(dá)CD29、CD44、CD166，不表達(dá)CD14、CD34、CD45、CD11a、CD90、CD105、C

4、D117。該胰腺干細(xì)胞與目前所報(bào)道的胰腺干細(xì)胞的表達(dá)特征基本一致。 該胰腺干細(xì)胞呈克隆性生長(zhǎng)。當(dāng)培養(yǎng)皿中細(xì)胞數(shù)較少時(shí)，可見(jiàn)多角形的上皮樣胰腺干細(xì)胞呈典型的單克隆方式生長(zhǎng)；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70％融合時(shí)，則呈鋪路石樣。接種培養(yǎng)1～4d，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢處于潛伏期；5～7d，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；之后生長(zhǎng)速度減慢進(jìn)入平臺(tái)期。與第30、44代細(xì)胞相比，第20代細(xì)胞從第6d起生長(zhǎng)較快。目前此胰腺干細(xì)胞已擴(kuò)增培養(yǎng)3年。 該胰腺干細(xì)胞植入裸鼠體內(nèi)后

5、，在其腹股溝處形成腫塊。移植后6周，取腫塊做切片。H．E染色，可見(jiàn)細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)分化形成的組織含有未成熟的腺泡樣結(jié)構(gòu)，而組織部分區(qū)域可見(jiàn)壞死細(xì)胞，可能是營(yíng)養(yǎng)缺乏所致。結(jié)合PDX-1、Nesfin、CK19免疫組化染色陽(yáng)性結(jié)果，提示該胰腺干細(xì)胞在體內(nèi)可自發(fā)分化為胰腺來(lái)源的細(xì)胞。體外采用添加煙酰胺、bFGF與HGF的無(wú)血清誘導(dǎo)液誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為DTZ染色陽(yáng)性的β細(xì)胞；采用β-Me誘導(dǎo)其分化為β-tublin免疫組化染色陽(yáng)性的神經(jīng)細(xì)胞；采用地

6、塞米松和Vc誘導(dǎo)其分化為甲苯胺藍(lán)染色陽(yáng)性的軟骨細(xì)胞；但是應(yīng)用5-氮胞苷并未將干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞，提示可能是該誘導(dǎo)條件不適合其向心肌方向分化或該胰腺干細(xì)胞分化能力有限。綜上，該胰腺干細(xì)胞體內(nèi)可自發(fā)分化為胰腺來(lái)源的細(xì)胞，體外可定向誘導(dǎo)分化為內(nèi)胚層的胰腺β細(xì)胞、中胚層的軟骨細(xì)胞及外胚層的神經(jīng)細(xì)胞，表明其具備多向分化潛能。 2 人胰腺干細(xì)胞誘導(dǎo)胰島樣細(xì)胞團(tuán)及其治療大鼠糖尿病采用無(wú)血清誘導(dǎo)液將隨機(jī)解凍的第18代人胰腺干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為胰島

7、樣細(xì)胞團(tuán)，DTZ染色陽(yáng)性，RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)錄胰島素mRNA，葡萄糖刺激能釋放胰島素。將獲得的胰島樣細(xì)胞團(tuán)植入STZ制備的糖尿病大鼠腎背膜下，移植后48h，血糖水平即明顯下降，維持約兩周時(shí)間，但其血糖濃度仍高于正常血糖濃度范圍；移植后第3周血糖濃度迅速上升，之后一直維持高血糖狀態(tài)。與胰島樣細(xì)胞團(tuán)移植組大鼠相比，糖尿病對(duì)照組大鼠血糖濃度一直處于糖尿病血糖濃度范圍內(nèi)。初步證實(shí)人胰腺干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的胰島樣細(xì)胞團(tuán)具有一定的抗大鼠糖尿病作用。