大鼠TRPV4與膜聯(lián)蛋白A2及微管蛋白β5相互作用研究.pdf

1、第一部分大鼠TRPV4全長及氨基端、羧基端胞質(zhì)內(nèi)片段和膜聯(lián)蛋白A2、微管蛋白β5全長表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)
　　 背景：
　　 瞬時感受器電位離子通道香草素受體亞家族4（transient receptor potential vanilloid receptor4，TPRV4）是一種非選擇性通透性陽離子通道，具有機(jī)械敏感性，其廣泛分布于動物腦、背根神經(jīng)節(jié)（dorsalrootganglion，DRG）、腎和肺等組織。TR

2、PV4可被多種刺激激活，開放時引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的明顯升高。TRPV4參與生物體傷害性感受的傳導(dǎo)，在DRG神經(jīng)元介導(dǎo)的疼痛傳遞過程中起重要作用。大鼠TRPV4全長為871個氨基酸(aminoacid，aa)，與其他TRP家族成員相似，TRPV4通道結(jié)構(gòu)包括氨基端(Ntermini，Nt)、羧基端(Ctermini，Ct)兩個胞質(zhì)內(nèi)片段及6個跨膜區(qū)(TM1-TM6)，并在TM5和TM6之間形成一個袢環(huán)結(jié)構(gòu)。目前認(rèn)為，TRPV4的胞質(zhì)內(nèi)

3、片段是TRPV4與其他蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)域。
　　 我們的前期研究提示，TRPV4與DRG損傷后的機(jī)械痛敏有關(guān)，但持續(xù)受壓后DRG上TRPV4通道表達(dá)升高的機(jī)制尚待研究。對持續(xù)受壓28天的大鼠DRG進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞骨架有關(guān)的膜聯(lián)蛋白A2的表達(dá)明顯增高，而細(xì)胞骨架微管蛋白β5明顯降低。因此推測細(xì)胞骨架（微管蛋白β5）及其相關(guān)蛋白（膜聯(lián)蛋白A2）可能通過某種途徑參與了機(jī)械性疼痛傳導(dǎo)過程中TRPV4通道表達(dá)的調(diào)控。

4、>　　 膜聯(lián)蛋白(annexins)家族是一類Ca2+依賴性膜磷脂結(jié)合蛋白。膜聯(lián)蛋白A2(annexinA2)是膜聯(lián)蛋白家族成員，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜動力學(xué)、囊泡運輸?shù)扔嘘P(guān)。S100A10-膜聯(lián)蛋白A2復(fù)合體可與TRPV5及TRPV6通道結(jié)合，調(diào)節(jié)通道活性。微管蛋白β5（tubulinβ5）是微管蛋白的一個亞型。α/β微管蛋白異二聚體是微管的主要組成部分，微管作為重要的細(xì)胞骨架成分在許多關(guān)鍵性細(xì)胞活動中發(fā)揮重要作用。微管與神經(jīng)元結(jié)構(gòu)與功能有關(guān)，

5、微管動力學(xué)的改變可以導(dǎo)致神經(jīng)的病理學(xué)改變。微管蛋白二聚體及聚合的微管可以Ca2+依賴性的結(jié)合于TRPV1，調(diào)節(jié)通道功能。目前有研究表明細(xì)胞骨架及其相關(guān)蛋白，如膜聯(lián)蛋白A2和微管蛋白β與細(xì)胞機(jī)械刺激傳導(dǎo)過程關(guān)系密切，但其分子機(jī)制尚不明確。
　　 很多既往研究提示TRPV4與膜聯(lián)蛋白A2及微管蛋白β5存在相互作用。本實驗旨在通過基因工程技術(shù)構(gòu)建重組真核表達(dá)載體，為下一步研究各蛋白的功能及相互作用提供必要的載體模型。
　　 目

6、的：通過基因工程學(xué)技術(shù)，克隆TRPV4及其N、C末端基因，構(gòu)建標(biāo)簽表達(dá)載體。用TRPV4各段及膜聯(lián)蛋白A2、微管蛋白β5標(biāo)簽質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，行westernblot及細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測其蛋白表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)分布情況。
　　 方法：以美國Duke大學(xué)W.Liedtke教授贈與的TRPV4cDNA全長質(zhì)粒為模板，設(shè)計特異性引物，采用PCR、酶切、連接、轉(zhuǎn)化、搖菌、質(zhì)粒提取等步驟，構(gòu)建TRPV4及其Nt、Ct帶Myc標(biāo)簽表達(dá)載體。以本課題

7、組制備的膜聯(lián)蛋白A2及微管蛋白β5的FLAG標(biāo)簽質(zhì)粒為模板，通過轉(zhuǎn)化、搖菌擴(kuò)增、質(zhì)粒提取等步驟獲得大量質(zhì)粒備用。
　　 TRPV4全長及胞質(zhì)內(nèi)片段、膜聯(lián)蛋白A2、微管蛋白β5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，采用westernblot和細(xì)胞免疫熒光檢測外源基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.TRPV4cDNA全長及氨基端、羧基端標(biāo)簽表達(dá)載體的成功構(gòu)建
　　 PCR成功擴(kuò)增TRPV4cDNA全長

8、及胞質(zhì)內(nèi)氨基端、羧基端基因片段，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在相應(yīng)位置出現(xiàn)DNA條帶。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切及測序鑒定。測序結(jié)果與Genebank基因序列完全一致，插入方向和讀碼框架正確，重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。
　　 2.TRPV4全長及各段載體、膜聯(lián)蛋白A2、微管蛋白β5在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá)
　　 TRPV4、膜聯(lián)蛋白A2、微管蛋白β5蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞蛋白樣品，分別在相應(yīng)98kD、39kD、55kD處出現(xiàn)單一蛋白條帶，pc

9、DNA3.1(+)空載體與pcDNA3.1-Myc，HisA空載體對照組和陰性對照組無特異條帶出現(xiàn)。
　　 重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48小時后，細(xì)胞免疫熒光檢測到外源基因在HEK293細(xì)胞中有表達(dá)。結(jié)果提示，TRPV4主要位于細(xì)胞膜，胞質(zhì)內(nèi)也有少量分布，膜聯(lián)蛋白A2在細(xì)胞膜和胞質(zhì)內(nèi)都有分布，微管蛋白β5也廣泛分布于胞膜和胞質(zhì)。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)空載體組和陰性對照組的HEK293細(xì)胞內(nèi)未檢測到標(biāo)記的蛋白熒光信號。<

10、br>　　 結(jié)論：
　　 本部分實驗成功構(gòu)建了TRPV4全長及氨基端、羧基端胞質(zhì)內(nèi)片段和膜聯(lián)蛋白A2、微管蛋白β5表達(dá)載體，并通過轉(zhuǎn)染使其在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。為后續(xù)在體外相對單純的環(huán)境下觀察TRPV4、膜聯(lián)蛋白A2、微管蛋白β5在傷害性刺激傳導(dǎo)的作用，及各蛋白間的相互作用研究打下基礎(chǔ)，提供必要的載體模型。
　　 第二部分大鼠TRPV4與膜聯(lián)蛋白A2、微管蛋白β5相互作用
　　 研究背景：DRG是痛覺傳入的第一級神

11、經(jīng)元，在神經(jīng)病理性疼痛的外周機(jī)制中起著重要作用。DRG神經(jīng)元作為感覺細(xì)胞，參與外周傷害性刺激傳導(dǎo)，其上聚集了許多傳感器受體及離子通道。研究發(fā)現(xiàn)TRPV4、膜聯(lián)蛋白A2和微管蛋白p5在CCD模型大鼠DRG中的蛋白表達(dá)發(fā)生了變化。TRPV4通道屬于TRP通道家族成員，是一種Ca2+通透性機(jī)械敏感性離子通道，表達(dá)于多種機(jī)械感受器細(xì)胞，可被多種刺激激活。所有的TRP通道都含6個跨膜區(qū)和氨基端及羧基端兩個胞質(zhì)內(nèi)片段。
　　 胞質(zhì)內(nèi)末端結(jié)構(gòu)

12、域含錨蛋白重復(fù)序列、PDZ-結(jié)合區(qū)及卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，被認(rèn)為是調(diào)節(jié)通道功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)區(qū)。許多研究提示TRP通道可通過直接相連，或中間的支架蛋白與細(xì)胞骨架的聯(lián)系。Α肌動蛋白將TRPP3錨定在肌動蛋白細(xì)胞骨架，并增強(qiáng)通道功能。另一個Ca2+高通透性TRP通道，TRPM7與肌動球蛋白(微絲)細(xì)胞骨架相連。微管蛋白β是一種TRPV1特異性相互作用蛋白。微管蛋白二聚體及聚合的微管可以與TRPV1結(jié)合，且這一結(jié)合是Ca2+敏感性的。小鼠MAP7是一種

13、TRPV-Ct結(jié)合蛋白，其可增強(qiáng)TRPV4在膜上的表達(dá)并可能與細(xì)胞骨架的微絲相連。TRPV4與微管及肌動蛋白細(xì)胞骨架存在直接相互作用，且主要作用于C末端。所有以上研究支持TRPV4與細(xì)胞骨架存在相互作用的觀點。
　　 膜聯(lián)蛋白A2是第一個發(fā)現(xiàn)與肌動蛋白細(xì)胞骨架相連的膜聯(lián)蛋白家族成員，其呈Ca2+依賴性與肌動蛋白絲結(jié)合。S100A10-膜聯(lián)蛋白A2復(fù)合體作為TRPV家族新成員，TRPV5及TRPV6的輔助蛋白，其與這些通道的結(jié)合對

14、通道活性的調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用。膜聯(lián)蛋白的功能是Ca2+依賴性的，而TRPV4是對Ca2+高通透性的，它們的功能都與Ca2+緊密聯(lián)系。微管蛋白β5屬于細(xì)胞骨架蛋白。肌動蛋白細(xì)胞骨架、微管蛋白和許多離子通道都通過整合蛋白和黏著斑與細(xì)胞外基質(zhì)相連，形成細(xì)胞的機(jī)械性結(jié)構(gòu)。機(jī)械力可通過細(xì)胞骨架傳導(dǎo)至機(jī)械敏感性部位，因此肌動蛋白和微管參與了細(xì)胞對機(jī)械性刺激的反應(yīng)過程。細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)在神經(jīng)元的功能中起重要作用。細(xì)胞骨架傳導(dǎo)機(jī)械力，TRPV4通道感受機(jī)械刺

15、激，因此推測細(xì)胞骨架與TRPV4之間存在相互作用。TRPV4可以調(diào)節(jié)微管和肌動蛋白，而微管動力學(xué)也可以影響TRPV4的活性。微管蛋白、肌動蛋白和傷害性信號元件在TRPV4-Ct構(gòu)成了一個超分子信號復(fù)合體。研究提示，細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)TRPV4通道的機(jī)械感受性，且它們的相互作用在神經(jīng)性病理疼痛的產(chǎn)生中發(fā)揮作用?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，我們推測TRPV4與膜聯(lián)蛋白A2及微管蛋白β5之間存在相互作用，且這一作用參與了神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生。
　　 本部

16、分實驗旨在在DRG組織及離體過表達(dá)細(xì)胞中檢測TRPV4與膜聯(lián)蛋白A2及微管蛋白β5之間的相互作用，從而為研究DRG受損后TRPV4介導(dǎo)的機(jī)械性痛敏的發(fā)生機(jī)制提供新的基礎(chǔ)，為臨床治療腰背痛等慢性神經(jīng)病理性疼痛提供新的思路。
　　 目的：檢測DRG組織及離體轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，TRPV4與膜聯(lián)蛋白A2及微管蛋白β5是否存在相互作用。
　　 方法：
　　 1．組織免疫共沉淀
　　 提取健康成年雄性大鼠腰椎DRG組織蛋白

17、，用TRPV4抗體行免疫共沉淀。沉淀后的復(fù)合物用TRPV4、膜聯(lián)蛋白A2及微管蛋白β的抗體進(jìn)行檢測，觀察是否存在目的蛋白。
　　 2．Western blot檢測共轉(zhuǎn)染細(xì)胞蛋白的共表達(dá)
　　 重組質(zhì)粒TRPV4與膜聯(lián)蛋白A2及微管蛋白B5質(zhì)粒分別以等摩爾比共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，提取蛋白后行westen blot，檢測共轉(zhuǎn)染蛋白樣品中各蛋白表達(dá)情況。
　　 3．共轉(zhuǎn)染細(xì)胞中TRPV4與膜聯(lián)蛋白A2的相互作用及共定

18、位檢測
　　 質(zhì)粒pcDNA3.1-TRPV4-Myc，His與pcDNA3.1(+)-Anxa2-FLAG等摩爾比轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48小時后，提取細(xì)胞蛋白，分別用anti-Myc及anti-FLAG抗體進(jìn)行免疫共沉淀。沉淀后的復(fù)合物行western blot分析，分別用anti-Myc(檢測TRPV4)及anti-FLAG(檢測膜聯(lián)蛋白A2)抗體檢測目的蛋白是否存在。
　　 爬片細(xì)胞共轉(zhuǎn)染48小時后，沖洗固定后行細(xì)

19、胞免疫熒光檢測，觀察兩種信號蛋白的共分布情況，并計算共分布系數(shù)。
　　 4．共轉(zhuǎn)染細(xì)胞中TRPV4與微管蛋白p5的相互作用及共定位檢測
　　 質(zhì)粒pcDNA3.1-TRPV4-Myc，His與pcDNA3.1(+)-Tubb5-FLAG等摩爾比轉(zhuǎn)染。HEK293細(xì)胞48小時后，提取細(xì)胞蛋白，分別用anti-Myc及anti-FLAG抗體進(jìn)行免疫共沉淀。沉淀后的復(fù)合物行western blot分析，分別用anti-Myc(

20、檢測TRPV4)及anti-FLAG(檢測微管蛋白p5)抗體檢測目的蛋白是否存在。
　　 爬片細(xì)胞共轉(zhuǎn)染48小時后，行細(xì)胞免疫熒光檢測，觀察兩種信號蛋白的共分布情況，并計算共分布系數(shù)。
　　 結(jié)果：
　　 1．組織免疫共沉淀
　　 經(jīng)TRPV4抗體沉淀的免疫復(fù)合物行western blot分析，可檢測到TRPV4、膜聯(lián)蛋白A2及微管蛋白p蛋白，即膜聯(lián)蛋白A2及微管蛋白p5均可被TRPV4抗體沉淀。

21、　　 2．Western blot法分別檢測共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞蛋白樣品的共表達(dá)情況。pcDNA3.1-TRPV4-Myc，His/pcDNA3.1(+)-Anxa2-FLAG表達(dá)載體組在相對分子量為98kD及39kD處分別出現(xiàn)單一蛋白條帶，pcDNA3.1-TRPV4-Myc，His/pcDNA3.1(+)-Tubb5-FLAG表達(dá)載體組在相對分子質(zhì)量為98kD及55kD處分別出現(xiàn)單一蛋白條帶。
　　 3．TRPV4與膜聯(lián)

22、蛋白A2的相互作用
　　 在共轉(zhuǎn)染細(xì)胞蛋白樣品中，TRPV4及膜聯(lián)蛋白A2不能相互沉淀。對兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的免疫熒光檢測可觀察到兩種外源性蛋白的共分布，共分布區(qū)域顯示為黃色。經(jīng)計算，兩種蛋白的Mander's共分布系數(shù)為0.58+0.113。
　　 4．TRPV4與微管蛋白β5的相互作用
　　 在共轉(zhuǎn)染細(xì)胞蛋白樣品中，TRPV4及微管蛋白B5可以相互沉淀。對兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的免疫熒光檢測可觀察到兩種外源性蛋白

23、的共分布，共分布區(qū)域顯示為黃色。經(jīng)計算，兩種蛋白的Mander's共分布系數(shù)為0.67+0.072。在TRPV4Nt與微管蛋白p5共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞蛋白樣品中，未檢測到兩者的免疫共沉淀。
　　 結(jié)論：
　　 TRPV4與微管蛋白β5、膜聯(lián)蛋白A2間存在相互作用。研究結(jié)果提示，TRPV4與微管蛋白β5相連，作為一個復(fù)合體發(fā)揮作用，但TRPV4與膜聯(lián)蛋白A2不是直接相連，可能是通過某些中問媒介相連，或僅僅在某些生理條件下相連。TR