豬繁殖與呼吸綜合征病毒流行病學(xué)研究及Nsp7β保守氨基酸對(duì)病毒增殖的影響.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRS Virus，PRRSV)引起的病毒性傳染病。PRRS給世界生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PRRSV不斷地突變和重組，致使多種變異毒株在各地流行傳播。此外，PRRSV具有十分獨(dú)特而復(fù)雜的免疫學(xué)特性，其致病機(jī)理也未完全揭示。因此對(duì)PRRS的控制并未取得實(shí)質(zhì)性成效。本文將從PRRSV

2、的流行變異情況和Nsp7β保守位點(diǎn)對(duì)病毒增殖的影響兩部分進(jìn)行探究，為PRRS的預(yù)防和治療奠定基礎(chǔ)。
　　(1)PRRSV流行病學(xué)研究
　　為了研究中國(guó)中部地區(qū)PRRSV的流行變異情況，擴(kuò)增并分析了31份ORF5基因和18份Nsp2基因的高度變異區(qū)?；谌L(zhǎng)ORF5核酸序列進(jìn)行遺傳系統(tǒng)進(jìn)化分析，其中18株分離株屬于NADC30-like毒株，11株分離株屬于高致病性毒株(HP-PRRSVs)。同源性分析結(jié)果顯示，NADC30-

3、like PRRSVs分離株彼此間核酸序列同源性為91.71％-99.34％，HP-PRRSVs分離株彼此的同源性為98.84％-99.67％。氨基酸(aa)序列比對(duì)結(jié)果顯示，HP-PRRSVs分離株幾乎沒(méi)有新氨基酸突變，但NADC30-like毒株則含有大量新氨基酸突變，尤其是GP5蛋白的誘騙表位、糖基化位點(diǎn)等重要基序區(qū)域。值得注意的是，NADC30-like分離株HNhx含有S32H、N33D、D34N和S36G氨基酸變異，導(dǎo)致其丟

4、失了aa30-35區(qū)段所有的糖基化位點(diǎn)。為了進(jìn)一步的了解當(dāng)前流行的NADC30-like毒株的特性，分離了特殊變異株HNhx。全基因組測(cè)序與重組分析結(jié)果顯示，HNhx毒株由NADC30毒株與高致病性毒株的疫苗毒株JXA1-P80重組而來(lái)，重組區(qū)域?yàn)镹sp4(nt5，261)-Nsp9(nt7，911)。以上結(jié)果表明，HP-PRRSVs依然在中部地區(qū)廣泛傳播，而NADC30-like毒株則逐漸開(kāi)始流行;HP-PRRSV毒株相對(duì)趨于保守，N

5、ADC30-like毒株則經(jīng)歷了快速變異和演化過(guò)程。
　　(2)Nsp7β保守位點(diǎn)的作用
　　對(duì)46株GenotypeⅡ型PRRSV毒株全基因組氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)雖然Nsp7β具有一定的變異性，但在所有PRRSV毒株中都存在一段21aa(aa30-50)的保守序列。進(jìn)一步與動(dòng)脈炎病毒屬中的其它成員比較發(fā)現(xiàn)，aa38位點(diǎn)在整個(gè)動(dòng)脈炎病毒科中都相對(duì)保守。為了研究Nsp7β保守區(qū)域和位點(diǎn)對(duì)Nsp7β功能的影響，以HP-PRR

6、SV毒株HN07-1為親本毒株建立了PRRSV反向遺傳操作平臺(tái)。首先對(duì)HN07-1毒株進(jìn)行了全基因組測(cè)序和分析，將全長(zhǎng)基因組分4段構(gòu)建到改造后的pCDNA3.1(+)載體中。同時(shí)也構(gòu)建了在ORF1b和ORF2間插入EGFP的重組質(zhì)粒。將構(gòu)建完成的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PRRSV易感細(xì)胞Marc145，并進(jìn)行盲傳，盲傳一代后，細(xì)胞出現(xiàn)了PRRSV感染典型的細(xì)胞病變效應(yīng)，Western blot和IFA試驗(yàn)結(jié)果表明病毒拯救成功。將重組毒株分別命名為rHN