細粒棘球絳蟲pET30a-EgA31-Eg95重組質粒構建及鑒定.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的：克隆細粒棘球絳蟲Eg95、EgA31抗原基因，構建pET30a-EgA31及pET30a- EgA31-Eg95原核表達載體，并在大腸埃希菌宿主系統(tǒng)中表達EgA31及EgA31-Eg95重組蛋白，對表達產物進行免疫印跡分析。方法：從細粒棘球絳蟲原頭蚴及成蟲組織中提取總RNA，反轉錄生成cDNA，分別以原頭蚴cDNA及成蟲cDNA為模板RT-PCR克隆獲得Eg95和EgA31抗原基因，將其克隆至pUCm-T載體，測序確定其正確性。利

2、用定向克隆技術將EgA31抗原基因片段克隆至原核表達質粒pET30a上，轉化E.coli DH5α，根據選擇標記的卡那霉素抗性基因篩選到陽性克隆，通過PCR分析和酶切鑒定篩選出陽性克隆，轉化BL21（DE3），IPTG初步誘導表達pET30a-EgA31重組蛋白，SDS-PAGE電泳檢測，凝膠圖像分析系統(tǒng)確定目的蛋白表達水平。以測序正確的pET30a-EgA31重組質粒為載體，運用酶切連接技術構建pET30a-EgA31 -Eg95重組

3、質粒，表達pET30a-EgA31-Eg95重組蛋白，SDS-PAGE電泳檢測，并經凝膠圖像分析確定目的蛋白的表達水平。結果：測序表明選取的pET30a-EgA31及pET30a-EgA31-Eg95陽性克隆均為正確連接目的基因的重組質粒。經IPTG誘導后重組蛋白均得到成功表達，分別在相對分子量約為31 kDa及46 kDa處有表達條帶，表達量約占菌體總蛋白質的26%及20%。結論：成功克隆并構建了pET30a-EgA31及pET30a

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