缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)基因沉默后對SW480人結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響.pdf

1、目的：臨床研究表明HIF-1α與結(jié)腸癌的臨床特征密切相關(guān)，本研究采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染介導(dǎo)的siRNA干擾技術(shù)，將干擾序列轉(zhuǎn)染SW480人結(jié)腸癌細(xì)胞并沉默HIF-1α表達(dá)，同時(shí)，觀察沉默后SW480細(xì)胞生物學(xué)特性的改變以期闡明HIF-1α基因?qū)Y(jié)腸癌腫瘤特性的影響。
　　方法:使用脂質(zhì)體法siRNA技術(shù)轉(zhuǎn)染SW480人結(jié)腸癌細(xì)胞株，并根據(jù)轉(zhuǎn)染時(shí)處理方式的不同將細(xì)胞株分為干擾組、陰性對照組、空載體組、空白對照組；使用Real-time P

2、CR技術(shù)對細(xì)胞株HIF-1α的mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測并計(jì)算沉默率；使用Western-blot技術(shù)對細(xì)胞株HIF-1α的蛋白表達(dá)程度進(jìn)行檢測，并評估蛋白表達(dá)水平；使用四甲基偶氮唑鹽法(MTT)技術(shù)評估細(xì)胞株的細(xì)胞增殖能力；采用流式細(xì)胞儀技術(shù)及AnnexinV-PI雙染法檢測細(xì)胞株凋亡；采用Luminometer技術(shù)檢測細(xì)胞株的細(xì)胞內(nèi)ATP含量。
　　結(jié)果：干擾組沉默率均>80％，空載體組及陰性對照組均<6%，證明SW480細(xì)胞HIF

3、-1α的表達(dá)受抑，符合預(yù)期要求；干擾組、陰性對照組、空載體組、空白對照組的HIF-1α蛋白的相對表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=12.473，p=0.012）。干擾組蛋白的相對表達(dá)量明顯低于其他3個(gè)對照組（P均<0.05），但其余三組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；SW480人結(jié)腸癌細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)各組間OD值均數(shù)均有差異(P＜0.05)；干擾序列轉(zhuǎn)染組與陰性對照組比較有顯著差異(P＜0.05)，且細(xì)胞增殖隨時(shí)間延長明顯受抑；HIF-1α干擾組、

4、陰性對照、空載體、空白對照組早期凋亡率分別為45.36%、4.43、3.48%、3.41%。晚期凋亡及壞死率分別為22.92%、4.75%、3.65%、3.74%。干擾組早期凋亡率及晚期凋亡和壞死率較陰性對照組、空載體和空白對照組顯著增加（P均<0.05），而后三者間兩兩比較無顯著性差異（P>0.05）；人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株細(xì)胞內(nèi)ATP濃度在各時(shí)間各組間的表達(dá)均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＜0.05)；組內(nèi)多重比較可知：培養(yǎng)后1-5天均表

5、現(xiàn)為干擾組ATP含量明顯低于陰性對照組、空載體組及空白對照組，而其余三組之間兩兩比較P均>0.05。此外，所有分組的人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株細(xì)胞內(nèi)ATP濃度均隨觀察時(shí)間的推移而進(jìn)行性降低（P均<0.05）。
　　結(jié)論：脂質(zhì)體法siRNA技術(shù)轉(zhuǎn)染干擾序列有效沉默人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株HIF-1α表達(dá)；HIF-1α沉默后可抑制人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞早期及晚期凋亡，并降低腫瘤細(xì)胞的ATP生成，且上述影響呈時(shí)間依賴性。