多房棘球絳蟲Em95抗原表位的研究.pdf

1、目的：篩選與克隆多房棘球絳蟲Em95抗原的表位，獲得高效表達(dá)含不同數(shù)量表位的肽段，制備多克隆抗體，鑒定和比較其抗原性與免疫原性。
　　方法：提取多房棘球蚴DNA，通過克隆、構(gòu)建、測序，利用DNAman軟件與MEGA4軟件對(duì)Em95基因特點(diǎn)進(jìn)行分析并構(gòu)建 Em95核酸序列的進(jìn)化樹進(jìn)一步探討其同源性。采用DNAStar軟件和在線網(wǎng)絡(luò)IEDB、SYFPEITHI和Propred等對(duì)Em95的B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測，尋找B細(xì)胞和T

2、細(xì)胞共同的區(qū)域。用DNAman軟件設(shè)計(jì)引物能擴(kuò)增出含一個(gè)T-B聯(lián)合表位的Em95-1肽段和含二個(gè)T-B聯(lián)合表位的Em95-2肽段。用RNA提取試劑盒從多房棘球蚴的原頭蚴中提取RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后克隆出Em95-1與Em95-2抗原基因，并構(gòu)建pMD18-T/Em95-1與pMD18-T/Em95-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliDH5a，測序鑒定序列正確。然后構(gòu)建pET32a/Em95-1與pET32a/Em95-2原核表達(dá)質(zhì)粒，再次

3、測序鑒定插入序列的正確性。pET32a/Em95-1與pET32a/Em95-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.co1iBL21(DE3)進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，用SDS-PAGE電泳分析鑒定重組蛋白的表達(dá)水平。表達(dá)的蛋白通過His-Binding-resin純化柱進(jìn)行純化獲得目的蛋白并用目的蛋白免疫動(dòng)物，采用硫酸銨沉淀法純化免疫家兔后的血清總 IgG，通過Western Blot法分析鑒定。
　　結(jié)果：成功克隆并構(gòu)建了pET32a/Em95-1與

4、pET32a/Em95-2原核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng) IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE檢測表明 rEm95-1與rEm95-2重組蛋白得到成功表達(dá)，在相對(duì)分子量為28kD與27kD處有表達(dá)條帶；Western Blot分析顯示rEm95-1與rEm95-2重組蛋白能被多房棘球蚴病人陽性血清識(shí)別，具有良好的抗原性。免疫家兔后制備的多克隆抗體具有較高的敏感性和特異性，且含有二個(gè)表位的rEm95-2與含有一個(gè)表位的rEm95-1的肽段均具有良好的抗原性與