PEG交聯(lián)去細(xì)胞瓣多信號(hào)復(fù)合材料生物學(xué)性能研究.pdf

1、第一部分:PEG 交聯(lián)去細(xì)胞瓣復(fù)合材料構(gòu)建及其體外生物相容性
　　 目的：PEG 交聯(lián)去細(xì)胞瓣構(gòu)建復(fù)合材料，并評(píng)價(jià)其體外生物相容性。
　　 方法：（1）合成功能團(tuán)為丙烯酰基的枝化狀PEG，同時(shí)在去細(xì)胞瓣上引入巰基，通過(guò)丙烯酰基與巰基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，構(gòu)建PEG 交聯(lián)去細(xì)胞瓣復(fù)合材料。（2）生物力學(xué)測(cè)試評(píng)價(jià)PEG 交聯(lián)對(duì)去細(xì)胞瓣機(jī)械性能的影響； CCK-8 法檢測(cè)復(fù)合材料浸提液對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖率影響，以評(píng)價(jià)其生物相

2、容性。
　　 結(jié)果：復(fù)合材料構(gòu)建條件溫和、效果確切；復(fù)合材料抗拉強(qiáng)度明顯高于去細(xì)胞瓣，且與天然瓣膜抗拉強(qiáng)度相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。復(fù)合材料與去細(xì)胞瓣毒性評(píng)級(jí)均為0 級(jí)，與陰性對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在含復(fù)合材料浸提液的培養(yǎng)液中形態(tài)良好，增殖旺盛。
　　 結(jié)論：PEG 交聯(lián)去細(xì)胞瓣的方法能夠構(gòu)建與天然瓣膜相似抗拉強(qiáng)度且無(wú)細(xì)胞毒性的復(fù)合材料。
　　 第二部分：PEG 交聯(lián)去細(xì)胞瓣多信號(hào)復(fù)合材料構(gòu)

3、建
　　 第一節(jié)：構(gòu)建RGD-復(fù)合材料
　　 目的：評(píng)價(jià)PEG 交聯(lián)去細(xì)胞瓣復(fù)合材料結(jié)合粘附肽（精-甘-天冬氨酸RGD 肽）的可行性和有效性。
　　 方法：復(fù)合材料與1ml 不同濃度（1.5mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml，0.25mg/ml）GRGDSPC肽溶液在37℃反應(yīng)，在不同時(shí)間點(diǎn)（1h，2h，4h），用分光光度法檢測(cè)復(fù)合材料結(jié)合GRGDSPC 肽質(zhì)量，并行免疫熒光定性檢測(cè)，去細(xì)胞瓣作為陰性對(duì)照

4、。
　　 結(jié)果：GRGDSPC 肽能有效地結(jié)合于復(fù)合材料，且一片復(fù)合材料與1ml GRGDSPC 肽（1mg/ml）在37℃條件下反應(yīng)2h，結(jié)合GRGDSPC 肽質(zhì)量最大為（0.79±0.01）mg。
　　 結(jié)論：PEG 交聯(lián)去細(xì)胞瓣復(fù)合材料，能夠在體外有效地結(jié)合RGD 肽，構(gòu)建RGD-復(fù)合材料。
　　 第二節(jié)：構(gòu)建VEGF-復(fù)合材料
　　 目的：評(píng)價(jià)PEG 交聯(lián)去細(xì)胞瓣復(fù)合材料結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（

5、VEGF）的可行性和有效性。
　　 方法：復(fù)合材料與1ml 不同濃度（500pg/ml，1000pg/ml，2000pg/ml）VEGF 溶液在37℃反應(yīng)，在不同時(shí)間點(diǎn)（1h，2h，4h，12h），用ELISA 法檢測(cè)復(fù)合材料結(jié)合VEGF 質(zhì)量，并行免疫熒光檢測(cè)，去細(xì)胞瓣作為陰性對(duì)照。
　　 結(jié)果：VEGF 能有效地結(jié)合于復(fù)合材料，且一片復(fù)合材料與1ml VEGF（1000pg/ml）在37℃反應(yīng)4h，其結(jié)合VEGF 質(zhì)

6、量最大為（896.87±3.27）pg。
　　 結(jié)論：PEG 交聯(lián)去細(xì)胞瓣復(fù)合材料，能夠在體外有效地結(jié)合VEGF，構(gòu)建VEGF-復(fù)合材料。
　　 第三節(jié)：構(gòu)建PEG 交聯(lián)去細(xì)胞瓣多信號(hào)復(fù)合材料
　　 目的：評(píng)價(jià)PEG 交聯(lián)去細(xì)胞瓣復(fù)合材料同時(shí)結(jié)合RGD 肽和VEGF的可行性和有效性。
　　 方法：復(fù)合材料與1ml 反應(yīng)液（包含1mg/mlGRGDSPC 肽和1000pg/mlVEGF）在37℃
　　

7、 反應(yīng)4h，對(duì)反應(yīng)后復(fù)合材料行免疫熒光檢測(cè)，去細(xì)胞瓣作為陰性對(duì)照。
　　 結(jié)果：GRGDSPC 肽和VEGF 能同時(shí)有效地結(jié)合于復(fù)合材料。
　　 結(jié)論：PEG 交聯(lián)去細(xì)胞瓣復(fù)合材料，能夠在體外有效地結(jié)合RGD 肽和VEGF，構(gòu)建PEG 交聯(lián)去細(xì)胞瓣多信號(hào)（RGD、VEGF）復(fù)合材料。
　　 第三部分：PEG 交聯(lián)去細(xì)胞瓣多信號(hào)復(fù)合材料生物學(xué)性能研究
　　 第一節(jié)：內(nèi)皮祖細(xì)胞分離、培養(yǎng)與鑒定目的：分離、培

8、養(yǎng)、鑒定臍帶血內(nèi)皮祖細(xì)胞，為其作為組織工程種子細(xì)胞提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：密度梯度離心法分離新鮮臍血中單個(gè)核細(xì)胞，在含堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子培養(yǎng)液中培養(yǎng)，通過(guò)形態(tài)學(xué)、免疫熒光和流式細(xì)胞儀等對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行鑒定；并與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行增殖和遷移能力比較。
　　 結(jié)果：隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，貼壁細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，從小圓變成梭形，逐漸形成特征性克隆和典型成熟內(nèi)皮細(xì)胞鵝卵石樣形態(tài)；體外培養(yǎng)7天后，90％以上貼壁

9、細(xì)胞呈Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I 雙染陽(yáng)性；貼壁細(xì)胞流式細(xì)胞儀分析顯示：培養(yǎng)7 d的細(xì)胞VEGFR-2、CD34和CD133表達(dá)分別占(77.35±4.86)％、(52.42±6.64)％和(19.36±2.14)％，培養(yǎng)28天的細(xì)胞VEGFR-2和CD34表達(dá)分別占(81.06±7.31)％和(7.62±3.14)％，而未檢測(cè)到CD133表達(dá)；人內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖和遷移能力明顯高于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。
　　 結(jié)論：用

10、密度梯度離心法和貼壁篩選法，可成功分離出臍帶血內(nèi)皮祖細(xì)胞，該方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、可行；且內(nèi)皮祖細(xì)胞可向內(nèi)皮細(xì)胞分化，增殖和遷移能力強(qiáng)，有望成為理想種子細(xì)胞。
　　 第二節(jié)：PEG 交聯(lián)去細(xì)胞瓣多信號(hào)復(fù)合材料生物學(xué)性能測(cè)定
　　 目的：研究PEG 交聯(lián)去細(xì)胞瓣多信號(hào)（RGD、VEGF）復(fù)合材料對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞粘附和增殖的影響，為進(jìn)一步構(gòu)建TEHV 提供依據(jù)。
　　 方法：A組去細(xì)胞瓣，B組PEG 交聯(lián)去細(xì)胞瓣復(fù)合材料，C組

11、VEGF-復(fù)合材料，D組為RGD-復(fù)合材料，E組PEG 交聯(lián)去細(xì)胞瓣多信號(hào)（RGD、VEGF）復(fù)合材料。然后在各組材料上種植EPCs，分別在種植后2h、4h、8h 用細(xì)胞計(jì)數(shù)和3H-TdR 摻入法檢測(cè)各組材料上細(xì)胞數(shù)和每分鐘脈沖數(shù)，反映EPCs在各組材料上粘附性；分別在種植后2d、4d、8d，用細(xì)胞計(jì)數(shù)和3H-TdR 摻入法檢測(cè)各組瓣膜支架上細(xì)胞數(shù)和每分鐘脈沖數(shù)，反映各組材料上EPCs 增殖情況。在種植8d 時(shí)，取各組瓣膜支架行蘇木素-

12、伊紅染色和掃描電鏡，以檢測(cè)EPCs在各組材料上生長(zhǎng)情況，并取E組支架材料上細(xì)胞行RT-PCR檢測(cè)t-PA和eNOS的表達(dá)，以評(píng)價(jià)新內(nèi)皮抗血栓形成功能。
　　 結(jié)果：（1）種植后2h、4h、8h 時(shí)各組細(xì)胞數(shù)和每分鐘脈沖數(shù)為：D組＞E組＞C組＞A組＞B組，其中A組與B組之間各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）,8h時(shí)D組與E組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余時(shí)間點(diǎn)各組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（2）

13、種植2d、4d、8d 時(shí)各組細(xì)胞數(shù)和每分鐘脈沖數(shù)為：A組均大于B組（P＞0.05），C組、D組和E組均大于同一時(shí)間點(diǎn)A組和B組（P＜0.05）；種植2d 時(shí)，E組＞C組（P＜0.05），D組＞E組（P＞0.05）；種植4d 時(shí)，E組＞D組（P＜0.05），D組＞C組（P＜0.05）；種植8d 時(shí)，E組＞D組（P＜0.05），D組＞C組（P＞0.05）。（3）蘇木素-伊紅染色和掃描電鏡檢測(cè)顯示：種植8d后，與其它組相比，E組瓣膜支架上可見(jiàn)