吉西他濱對CD34+CD38-髓系白血病干細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng).pdf

1、背景：
　　 白血病是由克隆中的多能干細(xì)胞或更早期的祖細(xì)胞基因突變產(chǎn)生，而停滯在細(xì)胞不同的發(fā)育階段，白血病細(xì)胞在骨髓和機體其他造血組織中大量增生并浸潤其他器官和組織，以致正常造血功能受抑制，是一類造血系統(tǒng)異常的惡性疾病。目前我國白血病的發(fā)病率大約為4～5/10萬，在所有惡性腫瘤所致的死亡率中，男性白血病發(fā)病率居第六位而女性居第八位。但是在兒童及35歲以下成人中白血病發(fā)病率居第一位，是導(dǎo)致青少年死亡的首要疾病。急性髓細(xì)胞白血病是成

2、人白血病的主要類型，大約占成人各種白血病的60％，死亡率較高。雖然近年來治療方法有了很大改進(jìn)，急性白血病的完全緩解率、生存率較前有明顯的提高，但15％-25％患者因為藥物抵抗仍不能獲得完全緩解，并且40％的完全緩解患者在兩年內(nèi)復(fù)發(fā)。白血病干細(xì)胞位于細(xì)胞克隆起始階段，具有跟正常干細(xì)胞一樣自我更新能力和分化潛能，但卻喪失正常干細(xì)胞的自我調(diào)控能力，被認(rèn)為是白血病發(fā)生的根源，其可以抵抗常規(guī)的化療和放射治療，又是白血病復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的種子細(xì)胞。只有消

3、除白血病干細(xì)胞才能提高白血病治愈率，降低復(fù)發(fā)率，以白血病干細(xì)胞為靶的治療正在成為治療的新定位。KG1a細(xì)胞株是從一男性急性髓系白血病患者體內(nèi)獲得，此細(xì)胞株對粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞集落刺激因子無反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)其高表達(dá)CD34抗原，部分缺失CD38抗原，白血病干細(xì)胞具有CD34+CD38-表型特性，由此可見，CD34+CD38-KG1a細(xì)胞是一種具有白血病干細(xì)胞表型的細(xì)胞株，可以應(yīng)用于對白血病干細(xì)胞的研究。具有CD34+CD38-表型的KG1a細(xì)

4、胞對化療藥物耐藥并抵抗自然殺傷細(xì)胞殺傷作用。因此，本研究擬以處于分化早期階段的急性髓系白血病KG1a細(xì)胞作為研究的靶細(xì)胞。
　　 吉西他濱(gemcitabine，GEM)結(jié)構(gòu)為2'-脫氧-2'，2'-鹽酸二氟胞苷(β2異構(gòu)體)，在結(jié)構(gòu)上與阿糖胞苷（Cytarabine，Ara-C）相似，系阿糖胞苷2'-碳上的氫和羥基被雙氟取代，是一種新型嘧啶類核苷酸抗代謝腫瘤藥物，并且還屬于細(xì)胞周期特異性抗癌藥。其主要作用于細(xì)胞S期，也可以阻

5、止G1期細(xì)胞向S期的進(jìn)展，以此來影響細(xì)胞周期重分布，使周期敏感細(xì)胞成分增加?，F(xiàn)已證實該藥目前廣泛應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌和乳腺癌等實體瘤治療。GEM在惡性血液系統(tǒng)疾病方面的應(yīng)用，國外開展了GEM治療難治性淋巴瘤及多發(fā)性骨髓瘤的臨床試驗，均取得較好的療效。而應(yīng)用于白血病的治療僅限于基礎(chǔ)研究階段。
　　 目前生物免疫治療是繼手術(shù)、化療、放療之后的一種新型治療方法。免疫治療具有抗原識別的靶向性和時空效應(yīng)性，是以白血病干細(xì)胞為靶的治療

6、的根據(jù)。固有免疫效應(yīng)細(xì)胞治療屬于生物治療的一種，其作用機制與化學(xué)治療不同，不存在耐藥性問題。自然殺傷(natural kill，NK)細(xì)胞是固有免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞，具有免疫監(jiān)視作用，可以清除HLA缺失的腫瘤細(xì)胞，決定腫瘤細(xì)胞被免疫效應(yīng)細(xì)胞殺傷敏感性主要來自HLA-KIR的錯配程度和活化性配體NKG2D(MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3)的表達(dá)水平。靜息狀態(tài)NK細(xì)胞受到腫瘤細(xì)胞表面NKG2D配體激活，具有殺傷功能，在

7、體外激活后可直接輸注應(yīng)用。通常白血病干細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，內(nèi)外源凋亡系統(tǒng)處于關(guān)閉狀態(tài)，表面免疫激活分子低表達(dá)。研究顯示，多酚類植物單體能分別激活白血病、淋巴瘤腫瘤干細(xì)胞表達(dá)MICA/B或ULBP分子，激活NK細(xì)胞;可調(diào)節(jié)CSC外源性凋亡受體DR、DcR、casapse-8的表達(dá)，使其成為殺傷敏感細(xì)胞。不同的細(xì)胞因子可以促進(jìn)NK細(xì)胞增殖，而GEM是否能調(diào)節(jié)具有白血病干細(xì)胞特性的CD34+CD38-早期急性髓系白血病KG1a細(xì)胞被機體免疫細(xì)胞

8、對其的殺傷敏感性呢？將是本實驗研究的重點。
　　 因此，本實驗以具有白血病干細(xì)胞特性的CD34+CD38-早期急性髓系白血病KG1a細(xì)胞為靶細(xì)胞，通過細(xì)胞克隆形成實驗來研究CD34+CD38-KG1a細(xì)胞的分化發(fā)育階段及自我更新能力。采用GEM為干預(yù)手段，并與阿糖胞苷作為對比，以細(xì)胞克隆，細(xì)胞周期，細(xì)胞凋亡等指標(biāo)，觀察GEM對CD34+CD38-KG1a細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響以及研究GEM是否能調(diào)節(jié)CD34+CD38-KG1a細(xì)

9、胞被外周血單個核細(xì)胞殺傷的敏感性，從而為GEM體外對抗白血病提供實驗室依據(jù)。了解GEM是否具有增強KG1a細(xì)胞被PBMC殺傷敏感性，為新的免疫治療方案提供新思路。
　　 第一部分、吉西他濱對CD34+CD38-髓系白血病干細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)
　　 目的：通過檢測干細(xì)胞表型、軟瓊脂克隆形成率檢測CD34+CD38-KG1a細(xì)胞分化發(fā)育階段及自我更新能力，采用GEM為干預(yù)手段，以細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、克隆形成為檢測指標(biāo)，觀察GE

10、M對CD34+CD38-KG1a細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)的影響。
　　 方法：
　　 流式細(xì)胞儀檢測(Flow cytometry，F(xiàn)CM) KG1a細(xì)胞表面CD34和CD38抗原表達(dá)水平;軟瓊脂半固體培養(yǎng)基集落形成法檢測CD34+CD38-KG1a細(xì)胞克隆形成率及GEM對KG1a細(xì)胞克隆形成率的影響;通過臺盼藍(lán)拒染法觀察不同濃度的GEM(0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L)和阿糖胞苷分別在24h、48h、7

11、2h對KG1a細(xì)胞的增殖影響;利用流式細(xì)胞儀檢測各濃度GEM(0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.5mg/L)和阿糖胞苷作用24h后對KG1a細(xì)胞周期變化的影響;流式細(xì)胞儀AnnexinV-FITC法檢測不同濃度的GEM(0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L)和阿糖胞苷作用24h后對KG1a細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的影響。
　　 統(tǒng)計學(xué)方法：數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，應(yīng)用SPSS13.0軟件處理數(shù)據(jù)，

12、多組間均數(shù)比較采用析因設(shè)計資料的方差分析，兩組均數(shù)比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 急性髓系白血病KG1a細(xì)胞中表型為CD34+CD38-KG1a細(xì)胞占(98.02±0.72)％。軟瓊脂培養(yǎng)按每孔2500個KG1a細(xì)胞，第14d、21d克隆形成率分別為(21.52±1.75)％和(23.97±0.64)％，說明實驗用KG1a細(xì)胞具有白血病干細(xì)胞表型及自我更新能力特性。0.05 mg/

13、L、0.1 mg/L、0.5 mg/L的GEM分別作用KGla細(xì)胞24d、48d、72d后，增殖抑制呈現(xiàn)時間和劑量依賴，抑制作用明顯強于同濃度同時間阿糖胞苷組（P＜0.05）。0.5 mg/L GEM作用KG1a細(xì)胞24小時后有(20.70±3.24)％的KG1a細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死，顯著高于鹽水對照組(7.59±1.80)％和阿糖胞苷組(14.22±1.41)％（P＜0.05)。而0.05 mg/L、0.1 mg/L GEM作用KG1a

14、細(xì)胞后其凋亡率與鹽水對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。0.05mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L GEM作用KG1a細(xì)胞24 h后，軟瓊脂培養(yǎng)第14d，0.1 mg/L和0.5 mg/L組形成的克隆率分別為(15.06±1.15)％和(3.75±0.38)％，低于對照組(21.52±1.75)％（P＜0.05），第21d克隆率為(15.61±1.08)％和(3.91±0.32)％，低于對照組(23.97±0.64)

15、％（P＜0.05），0.05 mg/L GEM組14d、21d的克隆數(shù)分別為(20.28±1.11)％、(18.23±15.73)％，與對照組(21.52±1.75)％和(23.97±0.64)％相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L GEM和阿糖胞苷持續(xù)作用組，按每孔2500個，軟瓊脂培養(yǎng)14d和21d均未見集落生長，與對照組(21.52±1.75)％和(23.97±0.64)％

16、相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。說明GEM抑制KG1a細(xì)胞克隆形成并呈現(xiàn)時間和劑量依賴。0.5 mg/L GEM作用KG1a細(xì)胞24d后存活率為(22.93±5.73)％，存活的KG1a細(xì)胞中(88.10±1.97)％細(xì)胞處于G0/G1期，較鹽水對照組(52.2±7.18)％增加35.9％(P＜0.05)，S期、G2/M期較對照組分別減少31.9％、4.6％（P＜0.05），而0.05mg/L和0.1 mg/L GEM作用KG1

17、a細(xì)胞24d后，G0/G1期細(xì)胞與鹽水對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 小結(jié)：
　　 1.本實驗所用KG1a細(xì)胞具有干細(xì)胞表型及生物特性。
　　 2.不同濃度GEM具有抑制CD34+CD38-KG1a細(xì)胞增殖作用，并具有劑量時間依賴性，且抑制作用優(yōu)于同濃度同時間組阿糖胞苷組。
　　 3.濃度為0.5mg/L的GEM可將CD34+CD38-KG1a細(xì)胞阻滯在G1/G0期。
　　

18、4.GEM對CD34+CD38-KG1a細(xì)胞具有早、晚期凋亡作用，誘導(dǎo)凋亡作用優(yōu)于同濃度阿糖胞苷組。
　　 5.GEM顯著抑制CD34+CD38-KG1a細(xì)胞的克隆形成能力，抑制CD34+CD38-KG1a細(xì)胞的自我更新和增殖潛能，同時持續(xù)平穩(wěn)的藥物濃度增強其抑制效應(yīng)，抑制作用均強于同濃度阿糖胞苷組。
　　 6.GEM對CD34+CD38-KG1a細(xì)胞增殖能力及克隆能力的抑制可能與其使CD34+CD38-KG1a細(xì)胞產(chǎn)生

19、G1/G0期周期阻滯和具有早、晚期凋亡作用有關(guān)。
　　 第二部分、吉西他濱對CD34+CD38-KG1a細(xì)胞被外周血單個核細(xì)胞殺傷的敏感性影響
　　 目的探討GEM作用前后CD34+CD38-KG1a細(xì)胞被未活化人外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)和IL-2、IL-15活化的PBMC殺傷的敏感性影響。
　　 方法：
　　 通過臺盼藍(lán)拒染法觀察

20、不同濃度的GEM（0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L）對KG1a細(xì)胞及PBMC的增殖抑制作用;LDH檢測0.1mg/L GEM作用48h后對CD34+CD38-KG1a細(xì)胞被IL-2、IL-15活化前后PBMC殺傷的敏感性影響;流式細(xì)胞儀檢測0.1 mg/L GEM作用48h后CD34+CD38-KG1a細(xì)胞表面NKG2D配體(MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3)的表達(dá)率。
　　 統(tǒng)計學(xué)方

21、法數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，應(yīng)用SPSS13.0軟件處理數(shù)據(jù)，多組間均數(shù)比較采用析因設(shè)計資料的方差分析，兩組均數(shù)比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 在濃度為0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L GEM作用下，隨著GEM濃度的遞增和作用時間延長，其對單個核細(xì)胞無增殖亦無毒性作用，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。未經(jīng)IL-2、IL-15活化的PBMC在效靶比為

22、10∶1、20∶1時，KG1a細(xì)胞被PBMC的殺傷率為(4.87±0.99)％和(6.31±0.46)％，經(jīng)GEM作用48h后KG1a細(xì)胞被未經(jīng)活化PBMC的殺傷率為(17.88±3.76)％和(36.60±4.27)％，分別增高了13.01％、30.29％（（P＜0.05）。同等條件下，經(jīng)IL-2、IL-15活化的PBMC在效靶比為10∶1、20∶1時，未經(jīng)GEM處理的KGla細(xì)胞在被IL-2、IL-15活化后的PBMC的殺傷率分別為

23、(25.63±2.95)％和(36.14±4.84)％，而經(jīng)GEM作用后的KGla細(xì)胞被IL-2、IL-15活化后的PBMC殺傷率則為(35.30±4.99)％和(53.74±7.74)％，分別增高9.67％，17.6％(P＜0.05)。實驗結(jié)果顯示，GEM能明顯提高KG1a細(xì)胞被活化前后PBMC殺傷的殺傷率（P＜0.05），且經(jīng)過IL-2、IL-15活化的PBMC細(xì)胞殺傷效應(yīng)明顯優(yōu)于未經(jīng)活化的PBMC(P＜0.05)。GEM作用48h

24、后檢測KG1a細(xì)胞表面NKG2D的配體(MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3)表達(dá)與作用前相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 小結(jié)：
　　 1、不同濃度GEM對PBMC增殖無明顯影響。
　　 2、IL-2、IL-15活化后的PBMC細(xì)胞殺傷效應(yīng)明顯高于未活化的PBMC。
　　 3、GEM能增強KG1a細(xì)胞被PBMC的殺傷敏感性。
　　 結(jié)論：
　　 1、GEM對